吡蟲啉降解菌群結構解析及菌株資源挖掘

排孜麗亞·帕爾哈提, 車 娟, 阿孜古力·庫爾班, 張 偉

(新疆師范大學生命科學學院 新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室, 新疆 烏魯木齊 830054)

吡蟲啉(imidacloprid,IMI)又稱咪蚜胺、滅蟲精、蚜虱凈，化學名稱為1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺，被廣泛用于防治蚜蟲、葉蟬、薊馬等刺吸式口器害蟲[1-3]。由于具有殺蟲譜廣、低毒(對哺乳類動物)、高效等特點[4]，有望取代高毒類有機磷、有機氯類農藥。目前，已在世界120多個國家使用，并已成為應用最廣的殺蟲劑之一[5]。研究表明，IMI具有土壤滯留性，使用3年后，仍可在未直接施藥的作物中檢出殘留物[3]，雖然對哺乳動物毒性不大，但是其在作物和土壤中的殘留對有益昆蟲蜜蜂造成的“種群崩潰綜合癥”、對陸生無脊椎動物的致死作用造成的土壤動物生態系統的破壞等危害越來越被關注[6-8]。新疆地處亞洲腹地，是典型的大陸干旱半干旱環境，氣候干旱少雨，土壤鹽漬化嚴重，但非常適合棉花的栽培種植[9]。自20世紀80年代起，棉花在新疆大面積種植[10]。阿克蘇等棉花主栽區連作現象極為突出，為了殺滅棉蚜等害蟲，吡蟲啉等農藥被廣泛、大量、常年施用，因此當地土壤農藥殘留及土壤生態環境問題引起了廣泛關注[11]。由于生物修復具有低成本、無二次污染等優勢被認為是解決土壤污染的很好方式，至今，國內外學者已經從自然界分離得到多種能降解吡蟲啉的細菌及真菌等微生物[12-14]，同時對其降解途徑等也做了深入研究[15-16]，但因為新疆特殊的土壤及氣候條件，類似的研究成果并不一定適合用來解決當地的土壤農藥污染問題。本研究擬從新疆當地土壤環境中分離吡蟲啉降解菌株，為解決當地土壤農藥污染提供菌株資源的同時，結合菌株功能系統地開展新疆特殊土壤環境特有微生物資源的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣采集 2015年6月5日采集自阿克蘇棉區連作10年以上的土壤(79°45′81″～79°46′55″E ，39°31′47″～39°45′50″N 之間)。按五點取樣法使用內徑6 cm的土鉆垂直鉆取1～20 cm深度土壤。將5個相同連作年限土壤合并為1個土樣，按上述方法分別取連作10、15、20和30年的4個土樣，-4 ℃保存，帶回實驗室-20 ℃保存。

1.1.2 培養基 ①基礎無機鹽培養基(g)：硝酸銨 1.0，硫酸鎂 0.2，硫酸二氫鉀 0.5，磷酸氫二鉀 1.5，氯化鈉 0.5，硫酸銨 0.5，蒸餾水1 000 mL, 1×105Pa滅菌30 min；②PDA培養基[17]；③高氏一號培養基[18]；④牛肉膏蛋白胨培養基[19]；⑤LB培養基[20]； ⑥Trace element solution培養基(g): 乙二胺四乙酸二鈉 5.2, 氯化亞鐵 1.5, 氯化鋅 0.07, 四水氯化錳 0.1, 硼酸 0.062, 氯化鈷 0.19, 二水合氯化銅 0.17, 氯化鎳 0.24,蒸餾水1 000 mL，1×105Pa滅菌30 min；⑦Vitamin solution培養基(mg): 維生素H 2.00, 葉酸 2.00,鹽酸吡哆醇10.00,硫胺素5.00, 維生素B25.00, 煙酸 5.00, D-泛酸鈣5.00, 維生素B120.10, 對氨基苯甲酸 5.00,硫辛酸 5.00,蒸餾水1 000 mL，1×105Pa滅菌30 min。以上培養基用氫氧化鈉調pH為8.0。固體培養基添加1.8%瓊脂粉。吡蟲啉直接加到培養基使其濃度為100 mg/L。

1.1.3 主要試劑 Ex-Taq酶、引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)和T-載體克隆試劑盒均購自上海生工。QIAGEN?DNeasy R ULtraClean?Microbial Kit提取試劑盒和膠回收試劑盒等均購自TIANGEN。吡蟲啉原藥購自廣西南寧廣酞農業化工有限公司(純度≥98%)。

1.1.4 儀器與設備 BIOTECH-5BG-7000超凈工作臺(上海百典儀器設備有限公司)；SIGMA 2-16P離心機(上海百典儀器設備有限公司)；MLS-37500電子天平(北京欣凱隆生物科技有限公司)；S1000PCR儀(Bio-Rad生物公司)；ChemiDocTM XRS+凝膠成像系統(Alpha innotech)；DYCZ-24DN電泳儀(北京六一儀器廠)；2800H高壓滅菌鍋(武漢沙特利生物器材有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 吡蟲啉降解菌群的富集 稱取采集到的4個土壤樣品各2.5 g混勻后加入到含有100 mL基礎無機鹽+吡蟲啉培養基(吡蟲啉濃度100 mg/L)的250 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min搖床黑暗培養7 d后，做為液體種子按3%接種量傳代于新的相同培養基中繼續培養。連續傳代6次以上，部分菌液保存，部分菌液用于提取菌群總DNA。按同樣的方法富集高效氯氰菊酯(GX)和克百威(KBW)降解菌，與吡啉降解菌做對比。

1.2.2 吡蟲啉降解菌群結構的測定 培養的菌群按照QIAGEN? DNeasyR ULtraClean? Microbial Kit步驟要求提取菌群總DNA，電泳檢測合格后，委托天津諾禾致源生物科技有限公司對樣品進行后繼建庫、數據處理和分析。具體方法參見文獻[21]。

1.2.3 吡蟲啉降解菌的分離、純化 使用基礎無機鹽培養基、PDA培養基、高氏一號培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、LB培養基(均添加吡蟲啉100 mg/L)、通過高通量測序結果設計的培養基、參考KOMODO培養基數據庫(the Known Media Database)(http://komodo.modelseed.org)設計的選擇培養基(配方見1.2)從菌群中分離各種微生物。將富集的吡蟲啉降解菌培養液進行適當倍數稀釋，涂布于上述培養基，37 ℃、濕度55%恒溫培養7～15 d后，挑取生長較快、菌落形態明顯不同的單菌落，連續劃線純化培養，獲得形態一致的單菌落，用于分類鑒定。

1.2.4 吡蟲啉降解菌的分類鑒定 使用TIANGEN基因組DNA提取試劑盒提取各菌株的DNA作為模板，采用16S rRNA通用引物27F/1492R擴增目的片段。PCR擴增體系為：模板1.5 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR Green Mix 25 μL,無菌水補至50 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s；54 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共30個循環；72 ℃ 7 min。PCR擴增產物送至上海生工進行測序，其中16S rRNA序列相似度較低的菌株再通過TA克隆方法獲得克隆子后再送至武漢昆泰瑞測序。 將菌株16S rRNA基因序列測序結果在NCBI網站上進行相似度比較，并提交到GenBank數據庫獲得菌株序列注冊號(MN463036-MN463048、MN044953-MN044983、MN540804-MN540831)。利用Mega-X軟件(版本10.0.5)對獲得的菌株16S rRNA序列進行多序列拼接，構建系統發育樹[22]。

2 結果與分析

2.1 吡蟲啉降解菌群高通量測序

吡蟲啉降解菌群測序結果顯示，總序列數145 335條，總堿基數56 532 027 bp，有效序列133 290條，占總序列的91.71%，無效序列12 045條。序列平均長度424 bp(其他為高效氯氰菊酯和克百威菌群對比數據)(見表1)。

2.2 吡蟲啉降解菌群群落結構分析

該菌群在門分類水平上，占比最高的依次為變形菌門(Proteobacteria，67.05%)、放線菌門(Actinobacteria，10.67%)、厚壁菌門(Firmicutes，9.99%)、綠彎菌門(Chloroflexi，4.1%)、酸桿菌門(Acidobacteria，2.84%)；在綱分類水平上為γ變形菌綱(Gammaproteobacteria，54.79%)、桿菌綱(Bacilli，9.03%)、δ變形菌綱(Deltaproteobacteria，6.09%)、放線菌綱(Actinobacteria，5.96%)、α變形菌綱(Alphaproteobacteria，3.75%)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria，2.28%)(圖1)；在科分類水平，為假單胞菌科(Pseudomonadaceae，22.55%)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae，14.4%)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae，12.54%)、氣單胞菌科(Aeromonadaceae，4.24%)、李斯特氏菌科(Listeriaceae，2.19%)、鏈球菌科(Streptococcaceae，1.39%)；在屬分類水平，最多的依次為假羊胞菌屬(Pseudomonas，16.33%)、莫拉氏菌屬(Moraxella，11.14%)、埃希氏桿菌屬(Escherichia，4.57%)、環絲菌屬(Brochothrix，2.19%)等，未能分類占58.13%(GX和KBW分別為高效氯氰菊酯和克百威菌群數據)(圖2)。

該菌群由1 377個OTU組成，與其他降解菌群相比較，特有OTU255個，核心OTU580個(圖3)。

2.3 常規培養基分離吡蟲啉降解菌株的分類鑒定

通過基礎無機鹽等常規培養基培養分離吡蟲啉降解菌共分離獲得48株菌。其中BP5等7株菌經16S rRNA測序并對比分別隸屬于Nocardioides(BP5)、Sphingopyxis(BG5)、Shinella(BP2)、Cellulosimicrobium(BJ17)、Agromyces(BP8)、Bacillus(BJ7)、Bosea(BJW8)等屬。菌株BP5與NocardioidesnitrophenolicusNSP 41同源性為98.08%，其他菌株相似度介于99.25%～100%之間(表2)。

圖3 吡蟲啉樣品與GX和KBW樣品韋恩圖Fig.3 Venn diagram of imidacloprid samples with GX and KBW samples

表2 7株菌株的測序結果及同源性分析

2.4 利用Vitamin solution培養基和Trace element solution培養基分離菌株的分類鑒定

利用吡蟲啉降解菌群結構數據設計的Vitamin solution培養基和Trace element solution培養基培養分離吡蟲啉降細菌，共分離出25株菌株。經16S rRNA測序并對比分別隸屬于Paenibacillus(BMV3)、Ammoniphilus(BMV5)、Planococcus(BMV7.1)、Brevibacillus(BMV14.1)、Paenibacillus(BLE1)、Bacillus(BLE3.1)、Sphingopyxis(BLE4)、Rhodococcus(BLE5)、Bacillus(BLE10.1)等屬。其中BMV5與AmmoniphilusresinaeCC-RT-E同源性為98.5%，BMV7.1與PlanomicrobiumokeanokoitesIFO 12536同源性為98.29%，BLE3.1與BacillushalosaccharovoransE33同源性為98.02%，其他菌株同源性介于98.22%～99.59%之間(表3)。為確保測序的準確性，對相似度較低的10株菌株再次進行了16S rRNA克隆測序，序列比對結果分別隸屬于Novosphingobium(BMVC4.1)、Ammoniphilus(BMVC5)、Planomicrobium(BMVC7.1)、Nocardioides(BMVC9)、Brevibacillus(BMVC10)、Nitratireductor(BLEC7)等屬?？寺y序并對比后，其中BMVC4.1與NovosphingobiumacidiphilumDSM 19966同源性為97.69%，BMVC5與AmmoniphilusresinaeCC-RT-E同源性為98.22%，BLEC7與NitratireductorindicusC115同源性為97.73%，其他菌株同源性介于98.3%～99.33%之間(表4)。

表3 9株菌株的測序結果及同源性分析

2.5 吡蟲啉降解菌群分離菌株的系統分類

通過常規培養基培養純化吡蟲啉降解菌，對從中獲得的BP5、BG5、BP2等7株菌株的16S rRNA序列GenBank相似性最高的菌株序列進行比對并構建系統進化樹。發現BJW8、BP2和BG5與Boseathiooxidansstrain BI-42、Sphingopyxisindicastrain DS15和Rhizobiumsubbaraonisstrain JC85等菌株聚為一簇。BJ7與Bacillussubtilissubsp. inaquosorum strain BGSC 3A28聚為一簇。BP5、BP8和BJ17與Nocardioidesnitrophenolicusstrain NSP 41、Cellulosimicrobiumcellulansstrain DSM 43879等菌株聚為一簇，其中BP5與BP8完全相同，可能是重復篩出的菌株(圖4)。

表4 10株菌株的克隆測序結果及同源性分析

圖4 基于16S rRNA基因序列構建的常規培養基分離株的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree construction of 16S rRNA gene based isolates in conventional medium

通過設計的培養基培養純化吡蟲啉降解菌群并對從中獲得的BMV3、BMV5、BMV7.1等9株菌株的16S rRNA序列與GenBank相似性最高的菌株序列進行比對，構建系統進化樹。結果表明，BLE1、BMV3分別與Paenibacilluslautusstrain JCM9073、Paenibacilluslautusstrain NBRC15380形成一簇，屬于Paenibacillus屬，這兩株菌雖然從不同培養基分離得到，但可能是重復菌株。BLE3.1與Bacillushalosaccharovoransstrain E33、Bacillusmalikiistrain NCCP-662形成Bacillus屬中的進化成員。其他各菌株也分別代表了Planomicrobium、Ammoniphilus、Sphingopyxis、Rhodococcus、Nocardioides等菌屬。

圖5 基于16S rRNA基因序列構建的特殊培養基分離株的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of a special medium isolated based on 16S rRNA gene sequence

3 討 論

研究表明，作物的種植及與其相配套的栽培管理措施能極大地引起土壤微生物群落結構組成的變化[23-24]。新疆地區的氣候和土壤性質造就了該地區擁有獨特的土壤微生物群落組成，而棉花長達10年以上的連作和雷同的施用農藥等栽培管理措施又促使該棉區土壤演替出了新的微生物群落結構組成[25-26]。本研究試圖從新疆特殊土壤環境中篩選出耐受或者能降解吡蟲啉農藥的菌株資源，為后期鹽堿土壤環境下修復吡蟲啉農藥污染和降解途徑研究提供材料。結果發現，源自該長期連作棉田的土壤微生物群落在吡蟲啉的脅迫下，富集到的菌群群落結構組成與原土壤微生物群落結構相比發生了巨大改變。首先，在門分類水平上占絕對優勢的門類減少了，且所占比例發生很大變化。如Proteobacteria門所占比例由25%增加到67%以上，Firmicutes門所占比例無明顯變化， Actinobacteria門所占比例減少了50%，而原來占比20%左右的Gemmatimonadetes門幾乎未檢測到。在屬分類水平上能被分類的比例由原來的不到8%增加到41.9%，占比超過1%的Pseudomonas、Lactococcus、Moraxella等8個屬都不是原土壤群落結構中的優勢屬。其次，與克百威和高效氯氰菊酯脅迫下形成的菌群相比，盡管菌群來源相同，但富集后的新菌群結構從門到屬等任何水平上優勢菌屬及其豐度都截然不同。由此可見，不同的農藥脅迫的確能富集到不同類型的菌群，且富集到的菌群結構組成趨于簡單、優勢菌屬占比明顯，能為進一步有目的的分離純化微生物提供參考。

未培養微生物資源的開發利用一直是微生物領域的研究熱點[27-30]。新疆特殊的地理環境孕育了特殊的微生物資源，但至今仍然缺少結合功能的系統性的開發[31]。第一，本研究結合近幾年發展起來的高通量測序技術和相近菌屬對培養條件和營養需求相似的特點[32-35]，首先獲取吡蟲啉降解菌群的優勢菌屬特性，然后參考KOMODO網站設計了兩種培養基試圖從該菌群中分離到其特有的菌株。結果針對特有菌屬設計的培養基與富集培養和常規培養基分離純化獲得的菌株有共同的也有不同的。如：在門水平上富集和常規培養基分離到的厚壁菌門(Firmicutes)占比最高，依次是變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)，未分離出綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Acidobacteria)；在綱分類水平上，Bacilli占比最高，依次為Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Actinobacteria；在科分類水平上，Paenibacillaceae占比最高，依次為Bacillaceae、Sphingomonadaceae、Nocardiaceae。而經設計培養基分離到的BMV1菌株與湯鳴強等[3]已報道的降解吡蟲啉的菌株BB-1(GU247754)均屬Ochrobactrum目，BLE5、BMV9、BMV12與Kandil等[12]報道的能夠降解吡蟲啉的菌株MK6(KR052814)均屬Mycobacteriaceae，BMV8與Sharma等[13]報道的降解吡蟲啉菌株Enterobactersp. ATA1(JX233483)隸屬于Gammaproteobacteria綱。通過基礎無機鹽培養基獲得的菌株與高通量測序結果菌群結構組成設計的培養基獲得的菌株的對比，BG5與BLE4Sphingopyxis屬，BJ7與BLE3.1、BLE10.1同屬Bacillus，其他菌株隸屬不同菌屬。通過基礎無機鹽培養基獲得的菌株與克隆測序的菌株對比，BP5與BMVC9同屬Nocardioides，其他菌株隸屬不同菌屬。第二，經設計培養基實際分離出來的菌株與高通量測序結果不完全一致，原因可能是部分菌株由于培養基或培養條件不能滿足其生長需要而未能培養出來，而恰好符合另一些菌株的需求，但總體上分離獲得潛在新種的概率有所提高。第三，根據高通量測序數據，吡蟲啉降解菌群中依然有很多尚未分離到的菌株，因此，將第一和第二與讀長能覆蓋整個16S核糖體序列的三代測序結合起來，設計出更多選擇培養基用來挖掘菌群中盡可能多的菌株，有待嘗試。

首先，根據吡蟲啉降解菌群結構組成，從門到屬分類的菌群中包括尚未報道的降解吡蟲啉的菌屬，而實際分離到的部分菌株初步分類結果，確與已經報道的降解吡蟲啉菌株有差異，原因可能是土壤樣品采集地環境導致的，因為使用的培養基以及培養條件與已經報道的差異不大。來自不同環境下的不同菌屬在降解吡蟲啉的代謝通路上可能有所不同。其次，在分離純化過程中發現，即使只使用不加吡蟲啉的基礎無機鹽培養基也能分離到一些菌株。如果說在固體培養基中這些菌株是利用瓊脂中少量的碳源生長，那么在菌群液體培養基中他們是如何協作的，他們存在的功能是否和吡蟲啉的降解有關等問題都值得深入探究。另外，已有的降解吡蟲啉的報道大多是關于單一菌株的，且具有較高的降解率，雖然是在吡蟲啉作為唯一碳源脅迫下連續傳代富集到的菌群，但其降解吡蟲啉的能力并不強，可能該菌群中關鍵降解菌株的培養條件未得到滿足，或菌群中存在與關鍵降解菌株競爭代謝中間產物的菌株。因此還需優化菌群培養條件、調整添加碳源種類，提高吡蟲啉降解率，篩選關鍵降解菌株。