雞糞堆肥發酵過程微生物數量與溫度及酶變化的相關性研究

敖 靜, 李 楊, 劉曉輝, 高曉梅, 孫玉祿

(遼寧省微生物科學研究院,遼寧 朝陽 22000)

畜禽糞便堆肥發酵是一種較為常用的固體廢棄物資源化處理手段，自然堆肥存在周期長、氣味大、發酵不完全等問題，需要人工添加腐熟劑提高堆肥發酵效率。堆肥發酵的本質實際上是微生物繁殖代謝有機物的過程[1]，在這個過程中，大量微生物和酶參與，將有機物分解利用轉化為無機態養分[2]。溫度也是堆肥過程中反應堆肥進程的重要參數，一般堆肥發酵都要經過起火、高溫、降溫、二次升溫、降溫等階段，在不同階段，微生物種類和活躍程度也有所不同，發酵過程中各種酶的變化趨勢可以反映部分微生物的活躍趨勢以及發酵程度[3]。微生物對有機物的分解代謝能力取決于酶的活性，不同的微生物分泌的酶的種類不同，堆肥底物越豐富多樣，所需要的酶系統就越復雜[4]。因此，對堆肥過程中微生物數量和溫度及酶的變化進行研究，有利于了解堆肥的生化過程，為進一步了解堆肥發酵中微生物的作用，更好地控制堆肥發酵工藝，以及微生物菌劑的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗原料 雞糞由遼寧省朝陽市興和牧業有限公司提供；杏鮑菇菌糠由遼寧省微生物科學研究院提供。各營養成分含量見表1。

1.1.2 培養基(g/L) ①NA培養基：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂粉18，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。②PDA培養基：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂粉18，蒸餾水1 L，pH自然。③高氏1號培養基：可溶性淀粉20，K2HPO40.5，FeSO4·7H2O 0.01，KNO31.0，MgSO40.5，NaCl 0.5，瓊脂粉18，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

1.2 方法

1.2.1 堆肥測溫及取樣 將杏鮑菇菌糠粉碎成渣，按15%(質量分數)的比例添加到雞糞中，將物料堆置在通風的溫室大棚內，堆成高約1 m，直徑約1.5 m的圓垛，堆體無需覆蓋。每天分別在10：00和15：00進行兩次測溫，將溫度計插入堆料中央處15～20 min，測定3次，取平均值作為堆料溫度。分別在發酵第3、6、9、12、15、18、21、24、27 和30天取樣。采取多點混合法，分別在堆體的上、中、下三個部位取樣，并充分混合，新鮮樣品直接測定或冰箱4 ℃保存備用。

1.2.2 堆肥過程中微生物數量測定 采用NA培養基、PDA培養基和高氏1號培養基，分別對細菌、真菌和放線菌進行培養[5]。采用平板計數法進行菌數測定。

1.2.3 堆肥過程中酶測定 ①纖維素酶測量(硝基水楊酸比色法[6])：稱取0.50 g堆料樣品于150 mL 的錐形瓶中，加入1%羧甲基纖維素鈉溶液20 mL、磷酸鹽緩沖液5 mL(pH值5.3～5.6)、甲苯1.5 mL，37 ℃培養72 h，過濾，濾液定容至25 mL，取1 mL濾液在540 mm處測光密度(A)，設置空白對照組。以培養72 h的1 g堆肥樣生成的葡萄糖mg數表示纖維素酶活性(單位：mg/(g·d)。②脲酶測定(靛酚藍比色法[7])：稱取堆料樣品5.00 g于100 mL的容量瓶中，加入甲苯1 mL，靜置15 min，然后加入尿素10 mL(10%)、檸檬酸鹽溶液(pH 6.7)20 mL，緩慢搖晃至液體混合均勻，37 ℃恒溫培養24 h，然后37 ℃蒸餾水稀釋定容，過濾，取2 mL濾液，加入10 mL蒸餾水，4 mL苯酚鈉，3 mL次氯酸鈉，充分震蕩，靜置20 min，稀釋至50 mL。1 h內578 nm處測A值，設置空白對照組。尿酶活性以24 h后100 g土壤中NH3-N的mg數表示(單位：mg/(g·d))。③蔗糖酶測定(硝基水楊酸比色法[8])：稱取0.50 g堆料樣品于150 mL的錐形瓶中，加入15 mL蔗糖溶液(18%)、5 mL磷酸鹽緩沖液、5滴甲苯，緩慢搖晃至液體混合均勻，38 ℃恒溫培養24 h，過濾，取1 mL濾液于比色管中，加入3 mL水楊酸，水浴鍋沸水加熱，待溶液呈現黃色停止加熱并冷卻，蒸餾水定容至50 mL，在580 nm處測定A值，設置空白對照組。以堆制24 h的1 g堆肥樣品所生成的葡萄糖mg數表示蔗糖酶活性(單位：mg/(g·d))。④過氧化氫酶測定(高錳酸鉀滴定法[9])：稱取0.50 g堆料樣品于150 mL的錐形瓶中，加入蒸餾水40 mL、H2O250 mL(3%)，密封處理后震蕩25 min，加入H2SO45 mL(1.5 mL/L)，過濾，取25 mL過濾液，0.02 mol/L KMnO4溶液滴定至微紅色，設置空白對照組。過氧化氫酶活性以單位堆肥樣品所消耗的0.02 mol/L KMnO4溶液的mL數表示(單位:mL/(g·25 min))。

1.2.4 分析方法 使用軟件IBM SPSS Statistics 21進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 堆肥過程中微生物數量與堆體溫度的相關性

在堆肥發酵過程中，細菌是數量最多的微生物，堆肥初期嗜溫細菌數量較多，在這個階段提供細菌生長繁殖的營養物質主要是易分解的糖類[10]。隨著發酵的繼續，堆體溫度逐漸升高，細菌主要以嗜熱的芽胞桿菌屬為主，最低生長溫度為30～45 ℃，具有多樣性的生理特性[11]。隨著嗜熱細菌的活性降低，堆體溫度也逐漸下降，嗜溫細菌又重新發揮作用，繼續利用剩余的營養物質，直到發酵過程結束。由圖1可以看出，堆肥發酵初期細菌數量為8.23×109cfu/g，隨著發酵的繼續，菌數逐漸增加， 6 d時菌數最高達16.8×109cfu/g。當發酵到12 d后，菌數有所下降，18 d發酵二次升溫，菌數有所增加，隨后又逐漸減少。細菌數量變化規律為增加、減少、增加、減少、穩定。

圖1 細菌數量與堆體溫度的變化曲線Fig.1 Change curve of the number of bacteria and the temperature in the composting material

真菌生長溫度為30～50 ℃，在發酵過程中對纖維素的分解起到一定作用[12-13]。由圖2可以看出，真菌菌數的變化與溫度關系密切，隨著溫度升高，菌數也隨之增加，發酵達到高溫階段嗜熱真菌起主要作用。當發酵9 d時，真菌數量達到峰值14.3×104cfu/g，12 d后，菌數有所減少，當發酵第二次升溫時，真菌菌數略有增加，之后開始下降直到發酵結束，可培養真菌菌數約為4.3×104cfu/g。

圖2 真菌數量與堆體溫度的變化曲線Fig.2 Change curve of the number of fungus and the temperature in the composting material

放線菌大多數為好氧菌，在堆肥發酵初期，與其競爭的其他微生物較少，所以發酵初期放線菌菌數較多[14]，由圖3 可以看出，6 d時菌數開始增加，9 d時達到峰值22.3×106cfu/g，之后隨著發酵的繼續，放線菌數開始下降。

圖3 放線菌數量與堆體溫度變化曲線Fig.3 Change curve of the number of actinomycetes and the temperature in the composting material

利用SPSS軟件，將細菌、真菌、放線菌數量分別與溫度進行Pearson擬合，結果如表2、表3和表4所示，細菌、真菌數量與溫度的顯著性差異值分別是0.046和0.034，在置信水平為0.05的條件下，認為細菌、真菌數量與溫度具有相關性，即95%的概率認為細菌、真菌菌數與堆體溫度呈正相關；放線菌數量與溫度無顯著相關性。

2.2 堆肥過程中微生物數量與酶活的相關性

纖維素在自然界的存在十分廣泛，但由于其難破壞、難降解的特性，很難被直接利用。堆肥發酵過程中，大量的酶起著至關重要的作用，纖維素酶在分解纖維素時起到促進作用，可以將纖維素分解成寡糖或單糖，有利于微生物的分解和利用。畜禽糞便中的纖維素既可以為微生物的生命活動提供能源，又可以為其提供碳源，在纖維素酶的水解作用下，纖維素被分解利用，所以可以通過纖維素酶的變化作為堆肥過程碳源利用的表征。在堆肥過程中，纖維素酶由大部分細菌和真菌產生[14]，研究纖維素酶與菌數的關系要看總的微生物數量，在試驗中，由于真菌和放線菌菌數相對于細菌菌數來說極少，可忽略不計，所有本研究中總菌數數據由細菌菌數代替。由圖4可以看出，纖維素酶變化趨勢與總菌數相近，發酵至6 d時，總菌數最多，此時的纖維素酶達到峰值16.8 mg/(g·d)，隨后開始下降，18 d時隨著菌數的增加，纖維素酶又呈上升趨勢，之后菌數降低，發酵結束，纖維素酶也降至8.3 mg/(g·d)。

表2 堆肥過程中細菌數量與溫度的相關性

表3 堆肥過程中真菌數量與溫度的相關性

表4 堆肥過程中放線菌數量與溫度的相關性

圖4 纖維素酶與總菌數變化曲線Fig.4 Change curve of the cellulase and the total number of bacteria

過氧化氫酶主要存在大多數細菌中，是一種末端氧化酶，催化過氧化氫分解成氧和水，在細胞體內起到了關鍵的生物防護作用[16]。過氧化氫酶能促進過氧化氫對各種化合物的氧化。堆肥的過氧化氫酶活性，與其呼吸強度和微生物活動相關，在一定程度上反映了堆肥微生物學過程的強度[17]。由圖5可以看出過氧化氫酶與細菌菌數變化趨勢相近，在發酵初期6 d時達到峰值，隨后隨著菌數的下降，過氧化氫酶也逐漸下降，18 d時細菌菌數增加，活躍度提高，過氧化氫酶也隨之略有增加，之后繼續呈下降趨勢。

脲酶是尿素氨基水解酶類的總稱，是一種由簡單蛋白質構成，具有氨化作用的水解酶。能夠催化尿素分解生成碳酸和兩分子氨，并釋放出NH3和CO2，具有高度專一性[18]。脲酶的活性與氮素代謝密切相關，脲酶活性反映了堆肥過程中含氮物質的礦化過程，是堆肥腐熟度的評價指標之一。在堆肥過程中，脲酶由有細菌、真菌和放線菌產生，研究表明，脲酶的活性與微生物量呈正相關，由圖6可以看出，脲酶在發酵初期較高，隨后逐漸下降，這可能是由于高溫期過后，微生物數量減少導致的。

圖5 過氧化氫酶與細菌數變化曲線Fig.5 Change curve of the catalase and the number of bacteria

圖6 脲酶與總菌數變化曲線Fig.6 Change curve of the urease and the total number of bacteria

雞糞的干物質中粗蛋白占31%～33%，在雞糞發酵過程中，蛋白的分解關系到堆肥發酵的腐熟程度和發酵后的肥料品質。蛋白酶是水解酶的一種，其主要由細菌產生，不僅可以反映蛋白的分解程度，還能體現細菌的活躍程度[19]。由圖7可以看出，發酵初期蛋白酶含量較高，隨著發酵的繼續前期略有增加為70.9 mg/(g·d)，隨著發酵的繼續，總體呈減少趨勢，這可能是蛋白質被分解而減少造成的。

利用SPSS軟件進行Pearson相關性分析，由表5可以看出，纖維素酶與總菌數的顯著性差異值為0.02，在置信水平為0.05的條件下，認為纖維素酶和總菌數具有相關性，即95%的概率認為纖維素酶和總菌數呈正相關；由表6可以看出，過氧化氫酶與細菌菌數的顯著性差異值為0.00，在置信水平為0.01的條件下，認為過氧化氫酶與細菌菌數具有相關性，即99%的概率認為過氧化氫酶與細菌菌數呈正相關。由表7和表8的數據得出，脲酶和蛋白酶與菌數無顯著相關性

圖7 蛋白酶與細菌菌數變化曲線Fig.7 Change curve of the protease and the number of bacteria

表5 堆肥過程中纖維素酶與總菌數的相關性

表6 堆肥過程中過氧化氫酶與細菌菌數的相關性

表7 堆肥過程中脲酶與總菌數的相關性

表8 肥過程中蛋白酶與細菌菌數的相關性

3 討 論

本研究在雞糞發酵的不同階段測定了微生物菌數和堆體溫度及酶活的變化情況，通過曲線直觀地看出細菌和真菌的菌數的變化趨勢與堆體溫度變化趨勢相近，利用SPSS軟件進行Pearson 相關性分析得出，細菌、真菌數量與堆體溫度的顯著性差異值分別是0.046和0.034，在置信水平為0.05的條件下，認為細菌、真菌數量與溫度具有相關性，即95%的概率認為細菌、真菌菌數與堆體溫度呈正相關；而通過軟件數據分析可以得出，放線菌菌數與堆體溫度無顯著相關性，這可能是由于放線菌大多數為好氧菌，在發酵初期氧氣充足，菌數比較高，但由于發酵進程的繼續，堆體的濃縮效應導致堆體內部氧氣減少，從而影響了放線菌的數量。

通過測定纖維素酶、過氧化氫酶、脲酶和蛋白酶，比較多種酶類與微生物菌數的關系，由曲線圖可以看出，纖維素酶和過氧化氫酶的變化趨勢與菌數的變化趨勢相近，通過SPSS分析可知，纖維素酶和總菌數具有相關性，95%的概率認為纖維素酶和總菌數呈正相關，99%的概率認為過氧化氫酶與細菌菌數呈正相關；脲酶和蛋白酶與菌數無顯著相關性，二者都參與發酵過程中氮的循還，這兩種酶也與微生物的數量和活躍度有關，出現無相關性的數據可能是由于底物在酶促反應中減少，導致這兩種酶總體呈下降趨勢。

通過本研究可以了解微生物數量和酶活在堆肥發酵過程中的相關性，可為畜禽糞便堆肥發酵，有針對性的添加菌劑，為更準確高效的利用有機廢棄物提供參考。