多重核酸即時檢驗在新型冠狀病毒肺炎診斷及鑒別診斷中的價值

劉 杰 曲 芬 戚麗華 任昊遠

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)屬于國家“乙類”傳染病，采取“甲類”傳染病防控措施[1-3]。感染主要為飛沫和近距離接觸傳播，可經人與人傳播，人群普遍易感，且重癥病例病亡率高[4-6]。有研究表明，COVID-19有可能轉成慢性的、像流感一樣長期在人間存在，潛在的風險可能是長期且巨大的，對此發熱門診應常態化，成為一項醫院的標準流程[7-8]。因此，醫院如何立足于在發熱門診建立快速診斷能力的建設非常重要。通過綜述多重核酸即時檢驗(point-ofcare test，POCT)對國際病毒分類委員會命名的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)的快速診斷及鑒別診斷的價值，為有效防控COVID-19疫情提供參考。

1 呼吸道病毒所致疾病的診斷與鑒別診斷

SARS-CoV-2屬于β屬的冠狀病毒，其基因特征與SARSr-CoV和MERSr-CoV有明顯區別[2]。世界衛生組織將SARS-CoV-2感染引起的疾病正式命名為“COVID-19”。流行病學調查[9]顯示，COVID-19大多數為輕癥病例，但具有高度傳染性，潛伏期多為1～14 d，病死率約為2%[10-11]。國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[2]中指出，COVID-19確診病例須病原學檢測呈陽性，即實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陽性；或病毒基因測序與已知2019-nCoV高度同源。COVID-19感染輕型表現需與其他病毒引起的上呼吸道感染相鑒別，尤其是對疑似病例要盡可能采取包括快速抗原檢測和多重聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)核酸檢測等方法，對常見呼吸道病原體進行檢測[2]。

造成呼吸道感染的病原體主要是各種呼吸道病毒，以及細菌、支原體、衣原體、真菌及寄生蟲等[12]。近年來，一些呼吸道病毒如甲型流感病毒、腺病毒以及不斷變異的SARS-CoV-2所導致爆發的疫情，成為公共衛生領域面臨的重要問題

2 呼吸道感染病原體的檢測現狀

呼吸道病原體的檢測方法主要有病原體培養法、膠體金篩查流感抗原、免疫血清學檢測抗體以及實時熒光定量PCR檢測核酸?？乖鹾Y檢測盡管快速，但其敏感性低且不能區分亞型；血清學方法只能檢測免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，且耗時較長；核酸檢測方法敏感性高，特異性強，可以區分亞型，但需要專業的實驗室和昂貴的儀器設備，操作復雜，對檢驗人員的資質要求較高，不能滿足基層單位篩查防控的需求。

2.1 呼吸道感染病原體抗體檢測

針對COVID-19的疫情，許多高新企業已成功研發了SARS-CoV-2的IgM抗體檢測試劑盒(膠體金免疫層析法)以及SARS-CoV-2的IgM抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法)2種檢測方法學的產品[13]。膠體金免疫層析法檢測試劑的特點為：15 min出結果，無需儀器，適合現場快速篩查。

呼吸道病原體九聯檢[14]采用九項呼吸道感染病原體IgM抗體檢測試劑(間接免疫熒光法)，同時檢測甲型流感病毒(influenza A virus，INFA)，乙型流感病毒(influenza B virus，INFB)，副流感病毒1型、2型及3型(parainfluenza virus type1，2，3 PIV)，嗜肺軍團菌(legionella pneumophila，LP)，肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)，Q熱立克次體(Q rickettsia，QFB)，肺炎衣原體(chlamydia pneumoniae，CPn)，腺病毒(adenovirus，ADV)，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)等9項病原體的IgM抗體。呼吸道病原九聯檢的檢測方法在呼吸道感染檢測中檢出的陽性率高，能夠同時檢測9種病原體，可及時發現感染的病原體，為臨床呼吸道感染疾病的診斷及鑒別診斷提供一定的支持依據。

2.2 單一呼吸道病原體擴增和檢測

2.2.1 甲型流感病毒快速基因分型POCT方法

ParaDNA核酸POCT檢測儀及其配套的HyBeacon熒光探針檢測技術，是當前POCT分子診斷的前沿代表[15]。該方法建立一種基于Beacon-ParaDNA技術平臺對甲型流感病毒進行快速基因分型的方法，由于具有準確度和靈敏度高、設計靈活、兼容性好、無交叉污染及支持現場快速檢測等特點，已廣泛應用于法醫學鑒定、病原微生物檢測、食品衛生安全以及藥物基因組學等領域。

2.2.2 基于CRISPR-Cas系統的CRISPR-nCoV試劑盒

2018年，Science封面文章表明，基因編輯工具CRISPR-Cas系統用于病原檢測，可實現2 h內鑒定區分人體樣本中的寨卡、登革熱、黃熱病毒和西尼羅河病毒。2019年9月，微遠基因與華山醫院感染科合作，快速超敏結核分枝桿菌診斷方法CRISPRMTB發表[16]。COVID-19疫情期間，微遠基因利用自有CRISPR病原診斷平臺，基于GISAID公布的SARS-CoV-2序列(BetaCoV/Wuhan/IPBCAMSWH-01/2019，Collection date：2019-12-24)，設計特定CRISPR檢測位點，開發出超高敏CRISPRnCoV檢測試劑盒。CRISPR-nCoV試劑盒靈敏度可低至單個拷貝，具備與其他冠狀病毒明確區分的高特異性，可檢測痰液、拭子、肺泡灌洗液等多種樣本類型，用樣量可以低至100 μl，實現了高特異性、單拷貝級別靈敏度以及40 min快速的SARS-CoV-2核酸檢測，并且檢測儀器便攜可拓展，具有實現床旁POCT的應用潛力。

2.2.3 等溫擴增技術在呼吸道病原體的應用

等溫擴增技術與傳統PCR相比，儀器簡單、擴增時間短，還保持了高靈敏性及特異性，適合快速檢測，在結核分枝桿菌等病原體檢測中被廣泛應用[17]。等溫擴增技術的反應原理不同，分為環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)、依賴核酸序列型擴增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、鏈置換擴增(strand displacement amplification，SDA)、滾環擴增(rolling circle amplification，RCA)、單引物等溫擴增(single primer isothermal amplification，SPIA)、交叉引物等溫擴增(cross priming amplification，CPA)以及新型等溫多自配引發擴增(isothermal multiple self-matching-initiated amplification，IMSA)等技術。但等溫擴增技術也具有對引物設計要求高、不能擴增較長目的片段及易產生假陽性等局限性，因此，此方法在SARS-CoV-2的檢測中能否克服上述缺陷，達到快速精準檢測的目的，仍有待于臨床進一步應用評估。

2.2.4 Alere i的COVID-19分子即時檢測POCT產品

Alere i檢測測試盒是采用恒溫核酸擴增技術-切口延伸擴增技術(nicking enzyme amplification reaction，NEAR)來檢測病毒核酸，使用特定捕獲酶來驅動擴增反應，該試劑一般包括有切口酶、前向模板核酸及反向模塊核酸和聚合酶等，其操作方法為：①將待測樣品加入到離心管A中；②用移液槍取一定體積待測樣品加入到離心管B中，該離心管中有反應所需的各種試劑；③將離心管B放入檢測儀器中進行反應，如PCR擴增儀等，反應一段時間后通過儀器檢測得出結果。檢測在5 min內即可給出陽性結果，13 min內給出陰性結果，是目前速度最快的即時檢測之一。該測試基于雅培的Abbott ID NOW診斷平臺。ID NOW?是一種快速、基于儀器的恒溫擴增檢測系統，用于感染性疾病的定性檢測，將在醫生辦公室、緊急護理診所和醫院急診科等廣泛的醫療保健環境中提供快速的結果。ID NOW于2014年首次推出，是甲型和乙型流感、甲型鏈球菌和呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)的分子床旁檢測平臺[18]。SARS-CoV-2試劑是新開發的產品，其Alere i檢測儀器和測試盒見圖1。

圖1 Alere i檢測儀器和測試盒

3 多重核酸POCT在呼吸道病原體檢測中的研究進展

由于可引發呼吸道感染的病原體種類繁多，患者可能攜帶不止一種病原體，不同病毒之間以及病毒和細菌之間的臨床體征和癥狀相互重疊，往往使得僅基于臨床表現的病因診斷變得困難，無法確定致病原因，導致經常規治療無效，造成抗生素濫用以及醫源性交叉感染，因此鑒別診斷COVID-19中最常見的病原體，如流感病毒，便于及時隔離不同型別和亞型的流感患者，對防止病毒的傳播意義重大。在排除樣本質量、樣本收集時機以及污染和技術問題的情況下，從咽拭子或其他呼吸道樣本中，多次、多種標本和使用多種熒光定量PCR檢測試劑盒，檢查出SARSCoV-2的RNA陽性，對病原學診斷有重要支持意義。但是如何能快速準確、高通量檢測出患者所感染的呼吸道病原體，一直是臨床診斷面臨的難點。

3.1 核酸POCT技術

核酸POCT技術[19]是現場使用便攜式核酸儀器及配套試劑，該儀器將核酸擴增、信號收集與結果分析功能整合，能夠快速完成檢測，并能有效防止交叉污染。目前，國內已有多家企業宣布研發出全自動核酸擴增檢測分析儀及配套試劑盒，其操作簡便，結果快速、準確，這對基層開展快速篩查具有重要意義，并緩解疫情患者診斷及鑒別診斷的壓力。隨著免疫層析技術、微流控芯片技術和環介導等溫擴增技術核酸POCT產品的不斷研發及應用，能夠對當前檢測形成有效補充。

3.2 多重核酸POCT進展

圖2 核酸檢測試紙原理

多重核酸擴增檢測[20]是一種速度快、靈敏度高且特異性強的檢測方法，能提供多目標產物的共擴增，從而對呼吸道疾病混合感染的預后和復發提供重要信息。多重核酸擴增可以顯著減少檢測操作時間和成本，并且能夠快速得到結果。博奧生物集團應用恒溫擴增和微流控碟式芯片相結合的技術，對13種常見下呼吸道病原體靶基因進行擴增和檢測，可為臨床提供更為快速可靠的實驗室診斷依據，且能提供多目標產物的共擴增，從而對呼吸道疾病混合感染的預后和復發提供重要信息。

3.3 RNA恒溫擴增-金探針層析法

RNA恒溫擴增-金探針層析法[21]是新一代的核酸檢測技術，通過膠體金條帶判讀結果的方法，對SARS-CoV-2和甲型、乙型流感病毒核酸及其他呼吸道病毒進行快速定性檢測，對臨床上確診SARSCoV-2有重要意義，其特點是以病原體的RNA為靶標核酸，在逆轉錄酶和T7RNA聚合酶的作用下，經過逆轉錄和轉錄過程，實現RNA核酸片段的擴增。然后采用金探針層析法，將RNA擴增產物-特異探針-金標探針復合物在NC膜上固定形成條帶，結果判讀一目了然。該方法可以將膠體金免疫層析技術的操作簡單、快速且價格低廉等特點應用到核酸的多重檢測中來，實現甲型、乙型流感病毒核酸+SARS-CoV-2核酸的膠體金標核酸POCT診斷試劑的開發，其原理是在核酸檢測試紙條上，將通用探針標記上膠體金顆粒后，固定于玻璃纖維素膜上，檢測病原體核酸時，設計兩套特異探針，即特異探針A和特異探針B。兩套探針的使用使得其中任何一套探針和病原體核酸擴增片段雜交失敗，都不能夠形成被試紙條檢出的復合物，也就出現不了陽性檢測結果，保證了檢測的特異性。只要設計針對不同病原體核酸的特異探針即可完成同一張試紙條多種核酸的檢測，可以大幅降低檢測成本。核酸檢測試紙原理見圖2。

該方法無需核酸提取，無需專業實驗室，無需生物安全柜和熒光PCR儀就可進行實驗，僅需直接將患者鼻咽拭子標本加入儀器，即可快速而準確地檢測出SARS-CoV-2和各種流感病毒，應用在門診或急診，患者可以快速獲得檢驗報告，推薦向基層和偏遠地區的醫療機構普及，尤其適合于發熱門診內的快速篩查2019-nCoV之用。

4 核酸POCT在疫情中的應用

在疫情防控工作中，方艙醫院發揮了至關重要的作用[22]。在方艙醫院經過實踐檢驗之后，將拓展到更多的使用場景。為此，需要將核酸檢測POCT化，配置到方艙醫院中，同時多重核酸POCT成為發熱門診的標配。對于當下POCT的局勢，檢測項目的選擇要比平臺的建立更為重要，因此可用于鑒別診斷COVID-19與常見呼吸道病原體的多重呼吸道病原學核酸檢測，包括臨床常見呼吸道病毒和支原體及衣原體感染的檢測，涵蓋腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、支原體、衣原體、甲型和乙型流感病毒及SARS-CoV-2核酸，以及鑒別診斷SARS和SARSCoV-2的雙項目檢測系統，可能為核酸POCT的終極方向。

SARS-CoV-2核酸檢測在COVID-19的診斷、療效監測及疫情防控中發揮了重要作用，而多重核酸POCT技術在呼吸道病毒檢測中的意義更加重要。作為一種包括SARS-CoV-2核酸試紙條檢測技術，成功的融合了膠體金快速的特點。通過試紙條檢測核酸，只需10 min左右即可進行結果判讀，在操作上也十分簡單，只需將核酸特異擴增物和檢測探針混合后滴到檢測試紙上即可，對實驗人員技術要求低，更無需特殊的儀器設備，易于核酸檢測向基層及偏遠農村醫療機構的推廣。

5 展望

對呼吸道病原體的快速檢測是對抗疫情的強有力工具。如韓國的“得來速”檢測法，“免下車”病毒檢測方式更安全、更迅速[23]。同時也減少了一線醫務工作人員接觸病毒的機會，患者對公共衛生設施的污染也較小。而應用POCT檢測SARS-CoV-2，操作簡便，結果迅速，適合現場檢測操作，也是認真貫徹落實“外防輸入、內防反彈”防控策略，及早發現和控制COVID-19傳染源，同時滿足有關單位和個人多樣化的檢測需求的措施和手段。目前COVID-19傳染的起源、發病的疾病譜及發病機制，仍有待于進一步研究發現，相信多重核酸POCT將為抗擊疫情做出巨大的貢獻。