南美白對蝦肉糜凍藏過程中蛋白質功能特性變化

嚴紅波，沈春蕾，張賓，蘇來金，繆文華，水珊珊*

1(浙江海洋大學 食品與醫藥學院，浙江 舟山，316022)2(溫州市農業科學研究院 溫州市特色食品資源工程技術 研究中心，浙江 溫州，325006)

南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)中蛋白質、維生素及人體所需的微量元素等含量豐富，據近年來的市場統計，我國蝦產量為110萬t，其中南美白對蝦海水養殖產量為5.58萬t[1-2]。目前南美白對蝦的應用主要集中在鮮食和冷凍加工方面，但是存在加工過程能耗大，對蝦產品研究較少及加工形式單一等問題。蝦糜制品以蝦為原料，一般經斬拌、成型、凝膠化制成的產品，具有營養價值高、易消化、風味鮮美、易貯藏、食用方便等優點，受到廣大消費者的青睞[2]。雖然蝦糜制品產量未見明確數據報道，但近年來呈增長趨勢。隨著消費者的需求增長和產品的多元化發展，對蝦糜制品的研究開發具有非常重要的現實意義。

蛋白質是蝦類肌肉組織的重要組成部分，對蝦類肌肉質量的好壞起著決定性作用。蝦類制品在貯藏過程中出現冰晶生長、重結晶及蛋白質變性等問題，導致肌肉凝膠能力和持水力降低[3-5]。目前，大部分的貯藏研究主要以魚糜研究為主，對南美白對蝦肉糜的研究還較少。袁麗等[6]的研究表明蛋白質冷凍變性程度受到蛋白質與水分相互作用的影響，蛋白質結構的穩定程度隨二者之間的作用力變大而增強。趙亞等[7]的研究發現Ca2+-ATPase活力受到蝦肉水分含量和溫度的影響，溫度升高和水分含量增加，Ca2+-ATPase的活力降低。在水產品冷凍過程中，國內外學者的研究主要集中在理化特性變化、抗凍保水劑研發等方面[8-9]，對蛋白質凍藏過程中蛋白質功能特性的機制鮮有報道。因此，探討凍藏過程中南美白對蝦肉糜蛋白質的凝膠特性及功能特性的變化，對其實際加工利用和新加工技術的應用有一定的理論指導意義。

本研究所用南美白對蝦糜是由南美白對蝦經采肉、高速搗碎(不經漂洗、精濾)獲得，是南美白對蝦肌肉的初級分離產物。以南美白對蝦仁為對照，將南美白對蝦肉糜凍藏于-18 ℃條件下，研究凍藏過程中南美白對蝦肉糜蛋白質凝膠特性和功能特性的變化，并分析其變化機制，以期為新加工技術的應用以及南美白對蝦資源的利用提供理論參考和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗原料：鮮活南美白對蝦，體長14～16 cm，2019年9月初購于浙江舟山老碶菜場。鮮活對蝦碎冰浸沒置于保溫箱，30 min內運輸至實驗室進行處理。

主要試劑：KCl，NaCl，NaOH、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸(TCA)、5,5-二硫二硝基苯甲酸等，均為分析純，購自國藥化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CF-16RN型高速冷凍多用途離心機，日本日立公司；751UVGD型紫外-可見分光光度計，上海第三分析儀器廠；TMS-PRO型物性測試儀，美國FTC公司；DIRECT-Q型超純水裝置，美國MILLIPORE公司；TUBE MILL 100 CONTROL型研磨機，IKA集團。

1.3 實驗處理

新鮮南美白對蝦用清水清洗后去蝦頭、殼及腸，采集蝦仁；取得的蝦仁用組織搗碎器高速切碎混合5 min，收集制作好的南美白對蝦肉糜樣品，將剩下的蝦仁用紗布拭干表面水分，分裝。樣品均置于-18 ℃冰箱貯藏。以同批次的凍藏完整蝦仁樣品為對照組，第0、10、20、40、60、80、100和120天取樣，解凍后用于各項指標的測定。

1.4 肌原纖維蛋白的制備

參照ZHANG等[10]報道方法。準確稱取5.0 g的蝦肉糜樣品，按1∶9(g∶mL)加入9倍體積生理鹽水，于冰浴條件勻漿處理(2 500 r/min，10 min)，得到的上清液，即為提取的肌原纖維蛋白溶液，置于4 ℃冰箱備用。

1.5 肌原纖維蛋白凝膠特性測定

1.5.1 肌原纖維蛋白凝膠制備

參照ZHANG等[10]報道方法。將提取的肌原纖維蛋白溶液置于25 mm × 40 mm玻璃瓶，保持液面高度為15 mm。采取二段式加熱，第一段水浴鍋加熱(45 ℃，30 min)，第二段水浴鍋加熱(80 ℃，30 min)，凝膠形成后，取出的玻璃瓶預冷后，用自來水冷卻至室溫。凝膠樣品置于4 ℃冰箱中過夜，取出過夜的樣品，室溫放置30 min后，用于指標的測定。

1.5.2 凝膠質構特性測定

參照賈慧等[11]報道的方法測定凍藏蝦仁與蝦糜肌原纖維蛋白的凝膠質構特性。室溫條件下，用質構剖面分析方法，在測定平臺上將準備好的樣品固定，用TMS-Pro物性測試儀測定肌原纖維蛋白凝膠的彈性和咀嚼性。

1.5.3 凝膠保水性測定

參照MAO等[12]報道的方法測定凍藏蝦仁與蝦糜肌原纖維蛋白的凝膠保水性。準確稱量空離心管質量(m1)及加入蛋白溶液后總質量(m2)。凝膠制備完成后，經8 000 r/min離心10 min(4 ℃)后去除水分，再稱量余下質量(m3)。保水性計算如公式(1)所示:

(1)

1.6 肌原纖維蛋白功能特性測定

1.6.1 溶解性測定

參照MASATO等[13]的方法測定凍藏蝦仁與蝦糜肌原纖維蛋白的溶解性。用雙縮脲法測定蛋白質量濃度，蛋白溶解度計算如公式(2)所示：

肌原纖維蛋白溶解度/%

(2)

1.6.2 濁度測定

參照SABOW等[14]的方法測定凍藏蝦仁與蝦糜肌原纖維蛋白的濁度，將肌原纖維蛋白溶液稀釋到2 mg/mL，在室溫恒溫20 min后，于340 nm比色，測溶液吸光度(OD340)即為肌原纖維蛋白溶液濁度。

1.6.3 乳化性及乳化穩定性測定

參照馮實[15]的方法測定凍藏蝦仁與蝦糜肌原纖維蛋白的乳化性(emulsifying activity index,EAI)及乳化穩定性(emulsion stability index,ESI)。EAI和ESI計算如公式(3)、(4)所示：

(3)

(4)

式中：ρ為蛋白質溶液的質量濃度，g/mL；φ為油相體積分數(φ= 0.2)；A0，A10為乳狀液在0 min、10 min的吸光值。

1.6.4 起泡性及起泡穩定性測定

參照BUHL等[16]報道的方法測定凍藏蝦仁與蝦糜肌原纖維蛋白的起泡性(foaming capacity，FC)及起泡穩定性(foaming stability，FS)。FC和FS計算如公式(5)、(6)所示：

(5)

(6)

式中：V0為勻漿操作停止時泡沫體積和液體體積之和；V10為操作停止10 min后的泡沫和液體總體積。

1.7 數據分析

試驗數據處理及作圖采用Origin 8.1、SPSS 19.0統計分析軟件，每個指標均平行測量3次，試驗的結果均為平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 凍藏蝦肉糜肌原纖維蛋白凝膠質構特性變化情況

彈性和咀嚼性反映食品恢復形狀的能力，可部分反映食物的口感[17]。如圖1-A所示，隨著凍藏時間延長，蝦糜實驗組與蝦仁對照組肌原纖維蛋白凝膠的彈性呈下降趨勢。凍藏第120天時，相比于初始值，蝦糜和蝦仁肌原纖維蛋白凝膠的彈性分別下降了0.59 N和0.265 N，蝦糜肌原纖維蛋白的彈性下降幅度顯著。這可能與凍結后形成的冰晶有關，使蛋白質冷凍變性和肌原纖維蛋白結構遭到破壞，最終導致彈性下降[18]。如圖1-B所示，隨著凍藏時間的延長，蝦糜實驗組與蝦仁對照組肌原纖維蛋白凝膠的咀嚼性呈下降的趨勢。凍藏第10天時，蝦糜實驗組的咀嚼性下降顯著，繼續凍藏，咀嚼性的下降速率減緩且逐漸趨于平緩；蝦仁對照組凍藏第10天時，咀嚼性下降不明顯，隨著凍藏時間的延長，咀嚼性下降幅度增加。這可能與凍藏過程中出現的自溶現象及蛋白質內部化學作用力變化有關[19]。

A-彈性；B-咀嚼性圖1 凍藏蝦仁與蝦糜肌原纖維蛋白凝膠 彈性和咀嚼性變化情況Fig.1 Changes in springiness and chewiness of myofibrillar gel from peeled shrimp and mashed shrimp samples during frozen storage

2.2 凍藏蝦肉糜肌原纖維蛋白凝膠保水性變化情況

持水力反映了肌肉維系水分的能力，蝦肉的質構、嫩度、多汁性等品質均與肌肉的持水力相關[20]。如圖2所示，隨著凍藏時間的延長，蝦糜實驗組與蝦仁對照組肌原纖維蛋白凝膠的持水力呈下降趨勢，尤其以蝦糜實驗組下降幅度最為明顯。凍藏第10天時，蝦糜實驗組樣品，其肌原纖維蛋白凝膠的持水能力相比于蝦仁對照組樣品，二者之間并無顯著性差異，短期凍藏并不會對蝦肉糜的持水能力造成顯著性影響。凍藏第20天時，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白凝膠的持水力分別下降10.77%和1.6%，蝦糜實驗組持水力下降明顯。凍藏第120天時，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白凝膠的持水力分別下降26.21%和12.14%，蝦糜實驗組持水性下降幅度比蝦仁對照組大。相比于組織結構被破壞的蝦肉糜樣品，以完整蝦仁組織狀態進行冷凍貯藏，對肌原纖維蛋白凝膠持水能力具有更好的保持作用。在蝦肉糜制備過程中，經高速組織搗碎后，肌纖維原有物理結構遭到破壞，致使肌原纖維蛋白部分結構及功能也會受到一定程度的影響，因此其貯藏過程中持水能力的下降速率更加顯著。這可能是因為蛋白質結合水脫離和自由水反復凍融誘導了水產品肌肉在冷藏、凍藏過程中出現汁液流失現象的發生[21]。向迎春[22]的研究結果表明，隨著貯藏時間的延長，中國對蝦的保水性變差，對蝦的保水性下降幅度增大。以上研究結果與本實驗得出的結果相似，進一步驗證了實驗數據的準確性。

圖2 蝦仁與蝦糜凍藏過程中肌原纖維蛋白 凝膠保水性變化情況Fig.2 Changes in water retention of myofibrillar gel from peeled shrimp and mashed shrimp samples during frozen storage

2.3 凍藏蝦肉糜肌原纖維蛋白溶解性變化情況

蛋白質功能性質受到蛋白質溶解性的顯著影響，蛋白溶解性降低，標志著肌肉品質不同程度下降[23]。如圖3 所示，隨著凍藏時間的延長，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白的溶解性呈下降趨勢。這可能是在凍藏過程中，蛋白結構發生改變，內部疏水基團、巰基暴露導致表面疏水性增加，降低蛋白質的溶解度[24]。凍藏第10天時，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白的溶解性下降明顯，這可能是因為肌原纖維蛋白的構象發生改變，聚集程度增大，降低了溶解度。凍藏第120天時，與凍藏初期相比，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白的溶解性分別降低了16.69%和18.7%，蝦糜實驗組的溶解度下降幅度比對照組小。蛋白質溶解性的降低一方面是蛋白質天然構象發生改變，蛋白聚集程度增大；另一方面是疏水性基團暴露，疏水性增加，降低了蛋白質的溶解性[5]。LEI等[19]的研究發現白蝦貯藏過程中，隨著貯藏時間的延長，蛋白溶解性降低，與本研究結果一致。

圖3 蝦仁與蝦糜凍藏過程中肌原纖維蛋白質溶解性 變化情況Fig.3 Changes in solubility of myofibrillar gel from peeled shrimp and mashed shrimp samples during frozen storage

2.4 凍藏蝦肉糜肌原纖維蛋白濁度變化情況

蛋白質溶液的濁度，可衡量肌原纖維蛋白的聚集程度，吸光度的增加表明形成了大的聚合物。如圖4所示，當溫度一定時，隨著凍藏時間的延長，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白的濁度呈增加的趨勢，蝦仁對照組的濁度增加幅度比蝦糜實驗組大。這可能是在凍藏過程中，肌原纖維蛋白被破壞，其內部基團暴露，蛋白聚合程度增大，肌原纖維蛋白的濁度增加。LEE等[25]在研究中發現，凍藏過程中的肌球蛋白在低溫下會發生聚集變性。此外，由結果還發現，當凍藏時間一定時，隨著溫度的升高，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白的濁度也呈增加的趨勢，50 ℃以上最為明顯，此溫度下，肌原纖維蛋白的濁度增加幅度逐漸變大。這可能是熱處理使蛋白質分子發生變性，內部基團暴露，共價鍵或非共價鍵交聯聚集的機會增大，肌原纖維蛋白熱誘導聚集程度不斷增強。這與YUAN等[26]的研究發現一致，肌球蛋白的熱誘導過程中，溫度在50 ℃以上主要是肌球蛋白的凝聚在起作用，此時蛋白極容易相互聚集。

圖4 蝦仁與蝦糜凍藏過程中肌原纖維蛋白質濁度變化情況Fig.4 Changes in protein turbidity of myofibrillar gel from peeled shrimp and mashed shrimp samples during frozen storage

2.5 凍藏蝦肉糜肌原纖維蛋白乳化特性變化情況

蛋白質乳化性是蛋白質的一項重要功能性質，指一定條件下蛋白質所能乳化油的量，包括乳化性和乳化穩定性2個方面。如圖5-A所示，隨著凍藏時間的延長，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白的EAI呈顯著的下降趨勢。凍藏第120天時，與凍藏初期相比，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白的EAI分別下降了14.39 m2/g和15.55 m2/g，蝦糜實驗組EAI下降的幅度比蝦仁對照組小。凍藏過程中，肌原纖維蛋白EAI下降，可能是凍藏時間的延長，肌原纖維蛋白結構的完整性被破壞，肌原纖維蛋白與脂肪之間的作用力減弱。也可能是因為蛋白質的降解和變性作用，使埋藏在內部的分子暴露出來，導致疏水性的增加，降低乳化性[27]。如圖5-B所示，隨著凍藏時間的延長，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白的ESI也呈顯著的下降趨勢。與凍藏初期相比，凍藏第10天時，肌原纖維蛋白的ESI下降明顯，蝦糜實驗組下降的幅度低于蝦仁對照組，分別下降了7.8%和9.9%。凍藏第120天時，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白的ESI分別降低了28.08%和31.67%，原因可能是凍藏過程中，蛋白質發生氧化和變性導致蛋白質結構遭到破壞，界面膜形成不穩定，最終導致蛋白質的乳化性和乳化穩定性下降[28]。

A-EAI；B-ESI圖5 凍藏蝦仁與蝦糜肌原纖維蛋白EAI和ESI 變化情況Fig.5 Changes in EAI and ESI of myofibrillar gel from peeled shrimp and mashed shrimp samples during frozen storage

2.6 凍藏蝦肉糜肌原纖維蛋白起泡特性變化情況

在食品產品中蛋白質的起泡性和泡沫穩定性的應用非常廣，對食品加工中具有重要作用[29]。如圖6-A所示，隨著凍藏時間的延長，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白的起泡性呈顯著的下降趨勢，凍藏第10天時，蝦糜實驗組肌原纖維蛋白的起泡性下降幅度低于蝦仁對照組，這可能是由于凍藏初期，溫度突然降低，蛋白質變性程度增大，蛋白質分子之間的作用力影響，降低了肌原纖維蛋白的起泡性。凍藏第120天時，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白的起泡性分別下降了55.66%和58.33%，原因可能是隨著凍藏時間的延長，肌原纖維蛋白變性程度加大，蛋白質的起泡性降低[30]。如圖6-B所示，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白的泡沫穩定性也呈顯著的下降趨勢。凍藏第120天時，蝦糜實驗組和蝦仁對照組肌原纖維蛋白的泡沫穩定性分別下降了56.67%和59.67%，蝦糜實驗組肌原纖維蛋白的泡沫穩定性下降幅度低于蝦仁實驗組。原因可能是凍藏過程中，蛋白分子結構展開導致內部疏水基團與巰基的暴露程度增加，內源蛋白分子形成非共價聚集體加劇，分子間的界面特性與擴散速率受到影響，泡沫穩定性下降[31]。

A-起泡性；B-泡沫穩定性圖6 凍藏蝦仁與蝦糜肌原纖維蛋白起泡性和 泡沫穩定性變化情況Fig.6 Changes in foamability and foam stability of myofibrillar gel from peeled shrimp and mashed shrimp samples during frozen storage

3 結論

在食品貯藏過程中，蛋白質功能特性的運用和發揮受很多因素的影響。從功能性的角度出發，分析蝦仁與蝦糜在凍藏過程中的品質變化可以看出，凍藏蝦仁與蝦糜肌原纖維蛋白凝膠特性、保水性、溶解性、濁度、乳化特性和起泡特性對凍藏蝦仁與蝦糜均有不同程度的影響。隨著凍藏時間的延長，在凝膠特性方面，蝦仁對照組肌原纖維蛋白的彈性和咀嚼性以及凝膠保水性比蝦糜實驗組更佳；而在功能特性方面，蝦糜實驗組的溶解性、濁度、乳化特性和起泡特性更好。因此，在實際應用中需要兼具蛋白質功能特性時，應綜合考慮這些因素，探討功能特性平衡點，發揮蛋白質的功能性質最大的優勢，以期為高值化生產加工提供新的思路和理論參考。