八棱海棠耐鹽株組培方法及其后代的耐鹽性研究*

胡愛雙，吳雅琴，程和禾，張小棟，李凱超，孫 宇，王文成

（1 河北省農林科學院濱海農業研究所，唐山063200）（2 國家林業和草原局鹽堿地中心）（3 河北省鹽堿地綠化技術創新中心）（4 河北省農林科學院昌黎果樹研究所）

據估計，全球約有1/5 的灌溉土地受到鹽漬化影響，這嚴重影響了當地農林業生產及生態環境建設[1-3]。種植耐鹽植物改良鹽堿地，成本低，效果好，是開發利用鹽堿地的有效途徑[4]。八棱海棠（MalusrobustaRehd.）屬薔薇科蘋果屬，小喬木，樹姿優美，花量大，觀賞價值高；根系發達，樹體強健，抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐貧瘠等[5]，是蘋果常用的砧木。八棱海棠中有極強的耐鹽株和耐堿株，是優異的耐鹽堿種質資源[6-9]。八棱海棠為高度雜合種，生產上多采用實生繁殖，優良性狀在子代中不能保持。組織培養是保持八棱海棠優良性狀的重要途徑。鄭志新等[10]、李文然等[11]、趙亮明等[12]對八棱海棠組織培養進行過研究，但未形成完整的體系，關于耐鹽八棱海棠植株的組織培養也未見報道。我們以前期篩選得到的耐鹽八棱海棠植株[13]為試材，對其開展組培快繁體系研究，并對其組培后代的耐鹽性進行鑒定，以期為耐鹽八棱海棠在濱海鹽漬地區的景觀或蘋果產業中的推廣應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

耐鹽八棱海棠植株由河北省農林科學院濱海農業研究所篩選獲得，并定植于該所現代農業成果轉化基地，5 年生；普通八棱海棠植株的組培苗由河北省農林科學院昌黎果樹研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1組織培養

（1）外植體。試驗在河北省農林科學院昌黎果樹研究所生物技術室進行。2018 年3 月中旬從八棱海棠耐鹽植株上剪取無病蟲害、葉芽飽滿的1 年生枝條，帶回實驗室，插入自來水中，放置于培養室培養。約1 周后葉芽萌動，枝條剪成單芽莖段，剝去鱗片，露出綠色葉片，用自來水沖洗干凈，在無菌條件下，放入100 mL 滅菌的三角瓶中，用70%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3 次，0.1%HgCl2消毒8～10 min，無菌水沖洗3～5 次，用手術刀切下休眠芽，接種到誘導培養基上，置于培養室培養。培養溫度為（25±2）℃，光照16 h/d，光照強度為2 000 lx。

（2）誘導培養基的篩選。MS（30 g/L 白砂糖，6.5 g/L 瓊脂，pH 值5.8）＋0.1 mg/L NAA（萘乙酸），加入不同濃度6-BA（6-卞基腺嘌呤），濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L。每瓶接種4 個芽，每個處理接種30 瓶，30 d 后統計各處理的芽誘導率。

（3）繼代培養基的篩選。將誘導萌發的芽接種在繼代培養基上。試驗設4 個組合，MS（30 g/L白砂糖，6.5 g/L 瓊脂，pH 值5.8）＋0.05 mg/L NAA，加入不同濃度6-BA，濃度分別為0.3、0.5、1.0、1.5 mg/L。每瓶接種4 個芽，每個處理接種30 瓶，30 d 后統計各處理芽的增殖系數。

（4）生根培養基的篩選。繼代培養30 d 左右，選取長1.5～2.0 cm 且有3 片以上舒展葉片的健壯苗，從基部切下，轉移到生根培養基上誘導生根。生根培養用1/2 MS 培養基（20 g/L 白砂糖，6.5 g/L瓊脂，pH 值5.8），附加0.3 mg/L IAA（吲哚乙酸）＋0.3 mg/L IBA（吲哚丁酸）、0.5 mg/L IAA＋0.5 mg/L IBA 或1.0 mg/L IAA＋0.5 mg/L IBA，每瓶接種5 株苗，每個處理接種30 瓶，30 d 后統計各處理生根株率，記錄根系生長情況。

（5）煉苗與移栽。幼苗長出不定根3～5 條、長3 cm 左右，移到日光溫室進行煉苗，用遮陽網遮陰，1 周后去掉遮陽網。煉苗15～20 d 后打開瓶蓋，3 d 后移栽。移栽時用鑷子從瓶中輕輕取出苗，用水洗凈根部瓊脂，栽植在裝有滅菌處理的蛭石、草炭土和細沙（1∶1∶1）的營養缽中，搭塑料小拱棚，溫度保持在25 ℃左右，濕度控制在85%～95%，1 周后逐漸通風，2 周后有新根產生，3 周后撤去塑料布。在溫室生長1 個月后，營養缽中的苗移入田間。

1.2.2組培苗耐鹽性鑒定

在耐鹽株系和普通株系的繼代增殖培養基中附加不同濃度的NaCl，濃度分別為0、0.15%、0.3%、0.45%、0.6%、0.75%，八棱海棠耐鹽株系和普通株系每個鹽濃度處理接種12 瓶，每瓶接種4 個芽。14 d 后觀察，根據葉片受害程度確定鹽害等級，計算各處理組培苗的鹽害指數。

鹽害分級標準：0 級，全株無鹽害癥狀；1 級，輕度鹽害，小于20%的葉片邊緣輕微發黃、枯焦；2 級，中度鹽害，近50%的葉片發黃、枯焦或脫落；3 級，重度鹽害，50%以上的葉片發黃、枯焦或脫落；4 級，極重度鹽害，90%以上的葉片枯焦、脫落或植株死亡。

鹽害指數（%）＝［∑（受害株數×相應級值）／（調查總株數×4）］×100

2 結果與分析

2.1 組織培養

2.1.16-BA 濃度對耐鹽株系芽萌發的影響

在MS＋0.1 mg/L NAA 培養基中，在1.0～2.0 mg/L 范圍內，6-BA 濃度越高，芽萌發率越高，但是6-BA 濃度為2.0 mg/L 的培養基，芽萌發后需轉入低濃度培養基才能正常生長，否則，葉片皺縮、畸形。誘導芽萌發的最適宜培養基為MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA。

2.1.26-BA 濃度對耐鹽株系芽增殖的影響

從表1 可以看出，在MS＋0.05 mg/L NAA 培養基中，6-BA 濃度對芽增殖和新梢生長的影響較大。隨著6-BA 濃度的增加，芽的增殖系數增加。6-BA濃度為0.3 mg/L 時，幼苗生長較弱；6-BA 濃度為1.5 mg/L 時，隨著培養時間的延長，幼苗玻璃化現象嚴重；6-BA 濃度為1.0 mg/L 時，1 代苗生長健壯（圖1），但連續3 代苗培養基中都附加1.0 mg/L 6-BA，幼苗容易產生玻璃化現象；6-BA 濃度為0.5 mg/L 時，幼苗生長健壯。建議試管苗繼代增殖培養基交替使用MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L NAA 和MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L NAA，以保證新梢的正常生長。

表1 八棱海棠耐鹽株系在不同6-BA 濃度培養基中的增殖培養情況

2.1.3IAA 和IBA 組合對耐鹽株系生根的影響

從表2 可以看出，以1/2 MS 為基本培養基，IAA和IBA 的濃度配比明顯影響根的質量和生長狀況。當配比為1.0 mg/L IAA＋0.5 mg/L IBA 時，幼苗的生根數最多，生根株率也高，但根多數由愈傷組織發生，移栽時易碰掉；當配比為0.3 mg/L IAA＋0.3 mg/L IBA 時，根生長正常，但生根數較少，生根株率也較低；當配比為0.5 mg/L IAA＋0.5 mg/L IBA時，生根數較多，生根株率最高，根系正常且健壯（圖2）。

表2 八棱海棠耐鹽株系在不同濃度IAA 和IBA 培養基中的生根培養情況

2.1.4煉苗與移栽

經過在日光溫室進行強光和開口煉苗后，再移栽至裝有滅菌基質的營養缽中，罩小拱棚保持溫濕度，耐鹽株系組培苗移栽成活率達90%（圖3）。

圖1 八棱海棠耐鹽株系組培苗

圖2 八棱海棠耐鹽株系組培苗生根情況

圖3 八棱海棠耐鹽株系苗的生長情況

2.2 組培苗耐鹽性鑒定

從圖4 和圖5 可知，隨著培養基中鹽濃度的增加，八棱海棠耐鹽株系和普通株系組培苗鹽害指數均升高，同一NaCl 濃度，普通株系鹽害指數明顯高于耐鹽株系。NaCl 濃度為0.45%時，耐鹽株系的鹽害指數僅為8.33%，鹽害非常輕微，而普通株系鹽害指數已達到58.33%，鹽害較重；NaCl 濃度為0.75%時，耐鹽株系的鹽害指數雖然達到41.67%，但組培苗尚都存活，普通株系已出現死亡現象。

圖4 八棱海棠耐鹽株系和普通株系鹽害指數隨NaCl 濃度上升的變化情況

圖5 八棱海棠耐鹽株系和普通株系在不同NaCl 濃度脅迫下的組培苗生長情況

3 結論與討論

本試驗的研究結果顯示，誘導八棱海棠耐鹽株系芽萌發的最適培養基為MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA，莖尖膨大，葉片正常；建議試管苗繼代增殖培養基為MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L NAA和MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L NAA 交替使用，增殖系數為2.9～3.8，苗壯、健康；最佳生根培養基則為1/2 MS＋0.5 mg/L IBA＋0.5 mg/L IAA，生根株率可達95.5%。在溫室進行強光和開口煉苗后，移栽至裝有滅菌基質（蛭石∶草炭土∶細沙=1∶1∶1）的營養缽中，罩小拱棚保持溫濕度，移栽成活率可達90%。

鹽害指數是根據植株生長表現性狀來反映植株受鹽害程度的指標[14-15]，鹽害指數越高，說明植株受到的鹽害越重。本試驗結果顯示，普通株系鹽害指數明顯高于耐鹽株系，說明耐鹽株系組培苗有較強的耐鹽性，且其耐鹽性在組培后代中得以遺傳。