間充質干細胞來源胞外囊泡在新型冠狀病毒肺炎中的潛在應用價值

楊琛，王利，張瑞，李春峰，冷同愛

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）自暴發以來迅速蔓延[1]，目前已成為全球公共衛生事件。截至2020年12月，全球累計確診COVID-19患者8 000余萬例，累計死亡患者170余萬例。危重型COVID-19患者死亡率較高，其中免疫系統過度激活引起的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）及多器官功能衰竭是其死亡的主要原因之一[2-3]。目前，COVID-19的治療仍以抗病毒、免疫調節、支持治療為主[4]，暫無特效治療方法，故探尋安全、高效的治療策略迫在眉睫。

間充質干細胞來源胞外囊泡（mesenchymal stem cells derived extracellular vesicles，MSC-EV）能夠選擇性聚集間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）來源的蛋白、mRNA、微小RNA（miRNA）、細胞因子、脂質等物質，并靶向投遞其內容物至目標細胞，進而發揮抗微生物、抗炎、免疫調節、組織修復、促血管生成、抗纖維化等作用，在免疫相關疾病及再生醫學中發揮著重要作用[5-6]。理論上，MSC-EV能夠促進SARS-CoV-2清除，抑制患者過度激活的免疫狀態，并促進受損組織、器官修復。此外，MSC-EV在保留MSC免疫調節及組織修復等功能的同時[7]還能夠規避MSC作為細胞組分相關的一些不良反應[6]。本文主要綜述了MSC-EV在COVID-19中的潛在應用價值，以期為COVID-19患者提供一種安全、高效的治療策略。

1 COVID-19發病機制

SARS-CoV-2通過棘突蛋白與Ⅱ型肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞、內皮細胞等細胞表面的血管緊張素轉換酶2受體結合并進入宿主細胞[8]，病毒RNA釋放入細胞內并轉錄病毒相關組分，進而引起宿主細胞損傷甚至死亡。SARS-CoV-2結構蛋白在宿主細胞內形成并組裝完成病毒復制，經過胞吐作用從宿主細胞內釋放出來，并通過呼吸道飛沫等途徑迅速在人群中傳播。SARS-CoV-2能激活機體固有及適應免疫應答。固有免疫系統的干擾素（interferon，IFN）、自然殺傷（natural killer，NK）細胞可識別病原體相關分子模式并引起細胞毒免疫反應，形成抗SARS-CoV-2的第一道防線。SARS-CoV-2可激活免疫細胞，而活化的細胞毒性T淋巴細胞及B淋巴細胞是適應免疫應答的主要參與者，可分別破壞病毒感染細胞、產生抗體并清除病毒。

眾所周知，機體的適應免疫應答在清除SARS-CoV-2方面發揮著積極作用，但不被控制的固有炎性反應及受損的適應免疫應答常會導致負面影響。研究表明，SARS-CoV-2可使CD4+T淋巴細胞分化為輔助性T（helper T，Th）1細胞，危重癥患者CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞及調節性T細胞明顯減少[9]，CD14+CD16+單核細胞、Th17細胞及表達穿孔素、顆粒酶的CD8+T淋巴細胞增多[10]，白介素（interleukin，IL）-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞刺激因子、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、IFN-γ誘導蛋白10、單核細胞趨化蛋白（monocyte chemotactic protein，MCP）-1、MCP-3、 巨 噬 細 胞 炎 癥 蛋 白（macrophage inflammatory protein，MIP）-1α、單核因子誘導IFN-γ、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等促炎性細胞因子水平明顯升高并形成細胞因子風暴[9，11-12]，細胞因子及趨化因子募集大量中性粒細胞及巨噬細胞并在肺部浸潤、釋放有毒遞質，引起肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷及通透性增加，炎性細胞及大量液體滲透至肺泡內及肺泡間隙，可導致纖維組織沉積、透明膜形成及肺泡壁彌漫性增厚[10，13]。研究表明，SARS-CoV-2所致的細胞因子風暴可引起心臟、肝臟、腎臟等多器官功能損傷甚至衰竭[14]，嚴重時甚至導致患者死亡[3]。

2 MSC-EV治療COVID-19的潛在作用機制

2.1 MSC-EV可促進病毒及細菌清除 MSC-EV可增強機體抗微生物作用，理論上能促進SARS-CoV-2清除。MSC-EV能夠投遞RNA至肺上皮細胞，阻止流感病毒復制并抑制其紅細胞凝集，進而抑制病毒引起的細胞凋亡[15]。在豬流感模型中，MSC-EV能夠明顯減少豬鼻拭子及肺部病毒載量，減輕流感病毒引起的急性肺損傷[15]。在細胞實驗中，MSC-EV能夠通過投遞 let-7f、miRNA-145、miRNA-199a、miRNA-221等miRNA至靶細胞而阻止丙型肝炎病毒復制[16]；MSC-EV能通過投遞線粒體至巨噬細胞而上調其氧化磷酸化水平并增強巨噬細胞的吞噬功能[17-18]。在小鼠大腸埃希菌肺炎模型中，MSC-EV通過投遞miRNA-145而抑制多藥耐藥相關蛋白1 RNA及蛋白表達，促進白三烯B4的產生[19]，增強單核細胞及中性粒細胞吞噬功能及抗菌活性，減少小鼠肺部細菌含量并降低菌血癥發生風險，進而有效減輕肺炎嚴重程度[7，19]。

2.2 MSC-EV可促進病毒及細菌感染所致肺損傷的修復與免疫調節 SARS-CoV-2感染后患者免疫系統過度激活，從而引起ARDS。理論上MSC-EV能夠通過多種免疫調節機制而抑制COVID-19患者免疫系統激活，從而改善患者肺內皮及上皮細胞通透性，加快肺泡液的清除，促進患者肺部炎癥的消失。MSC-EV能夠投遞環氧化酶2 mRNA、線粒體至靶細胞，促進前列腺素E2分泌、誘導巨噬細胞由促炎癥的M1表型向抗炎癥的M2表型極化[7，17，20]，抑制T淋巴細胞及中性粒細胞功能，并促進抗炎性細胞因子的分泌。MSC-EV能夠投遞mRNA、miRNA等物質，減少肺部中性粒細胞、巨噬細胞的浸潤[7，21]，抑制 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α 等促炎性細胞因子的分泌，促進IL-10、轉化生長因子β等抗炎性細胞因子的分泌[7，20-24]，從而減輕流感病毒引起的急性肺損傷[15]。此外，MSC-EV還能誘導Th1細胞轉化為Th2細胞，減少T淋巴細胞分化為Th17細胞，同時增加調節性T細胞[22]，減少肺泡液中蛋白及MIP-2含量，減輕肺水腫及內皮細胞通透性，從而降低大腸埃希菌所致肺炎小鼠的死亡率[7，18]。在小鼠ARDS模型中，MSC-EV可通過投遞血管生成素1（angiopoietin 1，Ang1）mRNA至靶細胞而上調Ang1表達[20]，減少中性粒細胞浸潤并降低MIP-2水平，進而發揮抗炎及保護內皮細胞功能、改善肺毛細血管通透性的作用[21]。在體外人肺大腸埃希菌重癥肺炎模型中，MSC-EV能降低肺內皮細胞蛋白通透性、加快肺泡液的清除，減少肺泡內細菌數量，從而減輕大腸埃希菌引起的肺損傷[25]。

2.3 MSC-EV可促進受損組織、器官的修復 SARS-CoV-2常引起患者組織、器官功能損傷，甚至發生多器官功能衰竭，這也是危重型COVID-19患者死亡的主要原因之一。理論上MSC-EV能夠促進COVID-19患者受損組織、器官修復，改善患者預后，可能的機制如下：MSC-EV表達的分化群（cluster of differentiation，CD）29、CD44、CD73等黏附分子能歸巢至損傷組織部位并發揮作用[6]；MSC-EV能夠投遞新陳代謝關鍵酶、功能性線粒體等物質至受損組織，增強肺泡上皮細胞線粒體功能及修復能力[17]，進而修復大腸埃希菌引起的肺泡上皮細胞損傷[7]；MSC-EV能夠投遞miRNA-21-5p并發揮抗細胞凋亡作用，減輕氧化應激誘導的肺上皮細胞死亡[24]；此外，MSC-EV還能通過投遞Ang1 mRNA至內皮細胞而促進Ang1分泌，修復IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎性細胞因子引起的內皮細胞損傷，改善肺毛細血管通透性[26]。有動物實驗結果顯示，MSC-EV通過調節單核巨噬細胞群而減少膠原沉積，預防及修復博來霉素引起的肺纖維化[23]。MSC-EV通過產生角質細胞生長因子、血管內皮生長因子、HGF等一系列生長因子[6-7，27]而在心肌梗死、肝損傷、腎損傷、神經系統損傷等方面表現出良好的組織修復作用[6，28]。

3 MSC-EV治療COVID-19的現狀

MSC-EV具備促進病原體清除、免疫調節、促進損傷的肺及其他組織、器官修復等作用，其在保留MSC作用的同時還能避免MSC相關不良反應，如不存在不受控制增殖及異位分化的風險。COVID-19患者常表現為高凝狀態，而MSC可表達組織因子并主要在肺毛細血管聚集，可能增加肺栓塞等血栓栓塞事件發生風險。而MSC-EV體積較小，易通過血管等物理屏障；此外，MSC-EV免疫原性低，其脂質雙分子層包膜能夠有效避免內容物被循環中的酶類等物質降解，具有良好的生物相容性和穩定性，故直接將藥物或miRNA等小分子物質裝載到MSC-EV內并通過其歸巢作用，有望在藥物投遞載體方面發揮一定作用。上述優勢使MSC-EV在COVID-19治療中具有一定潛力。

筆者以“COVID-19”“間充質干細胞外泌體”“間充質干細胞胞外囊泡”“MSC exosomes”“MSC extracellular vesicles”為關鍵詞，檢索國內外臨床試驗數據庫，共檢索到MSC-EV治療COVID-19的臨床試驗共4項，包括國內臨床試驗3項，其中MSC外泌體霧化吸入治療COVID-19的關鍵技術研究（ChiCTR2000030261）為隨機對照研究，但MSC外泌體具體干預措施尚未報道；MSC外泌體霧化吸入治療COVID-19的初步臨床研究（NCT04276987）為單臂臨床試驗，患者霧化吸入2.0×108個MSC外泌體，1次/d，療程為5 d；臍帶MSC聯合細胞外泌體靜脈輸注對COVID-19肺損傷修復的臨床應用研究（ChiCTR2000030484）為隨機對照研究，干預組患者靜脈輸注180 mg MSC外泌體，1次/d，共治療14 d，聯合靜脈輸注5×107個MSC，1次/周，共兩次。國外臨床試驗1項，為MSC外泌體霧化吸入治療SARS-CoV-2相關性肺炎的安全性和有效性評價（NCT04491240），試驗設計為隨機對照研究，MSC外泌體組患者霧化吸入（0.5～2.0）×1010個MSC外泌體，2次/d，療程為10 d。

已發表的1項前瞻性臨床研究結果顯示，24例危重型COVID-19患者接受1次骨髓來源MSC-EV靜脈注射后，19例（79.2%）患者臨床癥狀及氧合狀態明顯改善，17例（70.8%）患者臨床痊愈，3例（12.5%）患者仍危重但病情穩定，患者平均治療5.6 d后出院，該組患者存活率為83.0%（20/24）；此外，該組患者治療后CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞絕對值明顯升高，中性粒細胞絕對值明顯降低，C反應蛋白、鐵蛋白、D-二聚體水平明顯降低，治療及隨訪期間未發現不良事件發生，初步提示MSC-EV治療COVID-19患者是安全、有效的[29]。

4 小結與展望

SARS-CoV-2可引起患者免疫系統過度激活，導致ARDS及后續多器官功能損傷甚至衰竭，是COVID-19患者病情進展及死亡的重要原因。理論上MSC-EV能夠促進SARSCoV-2清除，抑制機體免疫系統過度激活，減輕炎性反應尤其是細胞因子風暴導致的肺泡上皮及血管內皮損傷，并通過組織修復作用而促進損傷的肺及其他組織、器官的功能恢復。此外，MSC-EV還具有良好的生物相容性和穩定性，能夠避免MSC相關不良反應。有臨床試驗初步顯示，MSC-EV治療COVID-19患者是安全、有效的[29]，其可能成為COVID-19的潛在治療策略。

但MSC-EV用于COVID-19患者的治療中仍有許多前期工作需要完成，盡管國際胞外囊泡協會對胞外囊泡的分離、純化、鑒定等做出一些基本要求[30]，但不同研究間的實驗流程仍存在差異，胞外囊泡的異質性及復雜性對實驗結果的解讀及進一步臨床試驗有一定影響。MSC細胞接觸方式與旁分泌機制在其發揮作用時均起關鍵作用，故單獨應用MSCEV能否達到MSC同等功效仍有待進一步研究。此外，MSCEV組織來源、母體細胞代數、內容物構成差異、是否需要預處理[7，18]及使用時機、劑量、頻次、途徑等因素對MSC-EV作用的具體影響均有待進一步研究[6]。目前MSC-EV治療COVID-19尚處于臨床試驗階段，其具體療效及安全性尚有待高質量臨床試驗進一步驗證。

作者貢獻：楊琛、王利、冷同愛進行文章的構思、設計及可行性分析，論文及英文的修訂，并負責文章的質量控制及審校；楊琛、王利、張瑞、李春峰進行文獻/資料收集、整理；冷同愛對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。