海水酸化和堿化對斑點海鏈藻光合生理特性的影響

范佳樂，李富田，徐軍田,2,3*

( 1. 江蘇海洋大學 江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2. 江蘇海洋大學 江蘇省海洋生物技術產業協同創新中心，江蘇 連云港 222005；3. 江蘇海洋大學 江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005)

1 引言

硅藻分布廣泛，在碳的生物地球化學循環中起到不可替代的作用，其貢獻約20%的全球初級生產力和40%的海洋初級生產力[1]。在近海水域，硅藻作為初級生產者，構成海洋食物網的基礎，支持著沿岸漁業；而在大洋水域，從表層沉降下來的硅藻有機體是深海生物的重要食物來源[2]。

在過去的幾十年間，大氣CO2濃度從工業革命前的280×10?6升高到了現在的400 ×10?6[3]。作為主要的溫室氣體，大氣CO2濃度的升高導致全球變暖。與此同時，海水吸收了人類排放CO2的30%左右，這在一定程度上緩解了全球變暖的趨勢，但也導致了海水pH 下降，即海洋酸化。大氣CO2的溶入會引起海水碳酸鹽系統發生一系列變化：碳酸根離子（ CO23?）濃度大幅下降，碳酸氫根離子（ HCO?3）濃度略有升高，而溶解的CO2和氫離子（H+）濃度顯著增加[4]。研究還表明，大氣CO2的溶入會導致海水緩沖能力的降低，這意味著生物代謝活動對海水碳酸鹽系統的改變會在一定程度上加劇[5]。

在近海水域，海水碳酸鹽系統受諸多因素影響，呈現季節性甚至晝夜動態變化的特點。生物代謝是影響近海水域pH/pCO2的重要因素之一[6]。全球氣候變化和人為因素的共同作用導致近海富營養化程度加大，這將加劇沿岸海域浮游植物的暴發性增長[7]，使海?氣界面的氣體交換速度低于水體內的無機碳消耗速度，最終將抑制浮游植物的生長[8]。有研究發現，在封閉的海灣發生藻華時，海水pH 會達到10，而pCO2會降至50 μatm 以下[9–12]。因此，近海水域的浮游植物不僅會面臨海洋酸化的影響，海水堿化也是一個不可忽略的因素。

在表層海水中，與 HCO?3相比，溶解性CO2濃度相對較低，在當前海水平均pH（約8.8）條件下，CO2占溶解性無機碳（Dissolved Inorganic Carbon, DIC）的比例不到1%。而CO2是光合作用關鍵酶1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）所催化的羧化反應的唯一底物。硅藻Rubisco 的CO2半飽和常數（Km）為20～60 μmol/L，高于當前海洋中溶解CO2濃度[13]。為避免細胞受到碳限制，硅藻進化出了CO2濃縮機制（CO2Concenteating Mechanism, CCM）以提高Rubisco 周圍的CO2濃度，削弱光呼吸，提高光合固碳效率[14]。不同硅藻的CCM 差異顯著，雖然大部分硅藻都可以利用CO2和H CO?3，但是兩者利用的優先性及比例不同[15]。研究發現，在當前海水pCO2水平下，威氏海鏈藻（Thalassiosira weissflogir）對CO2和 HCO?3的吸收速率相同，三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）優先吸收 HCO?3[16]，而中肋骨條藻（Skeletonema Costatum）則優先利用CO2[17]。也有一些硅藻只能利用CO2，如斑點海鏈藻[18]。因此，對于硅藻而言，能吸收利用 HCO?3的物種比那些依賴于CO2作為唯一碳源的種類來說具有更大的競爭優勢。

pCO2升高和海水酸化對硅藻的影響，在生物碳泵和硅的生物地球化學循環中起著至關重要的作用，引起科學界的廣泛關注。研究發現，pCO2升高會下調硅藻的CCM[19]，CCM 的下調所節省的能量可以用于促進光合作用與生長[20]。同時，pCO2升高，海水酸性的增加，會導致細胞內pH 降低，從而增加維持胞內pH 平衡的能量投入[21]。海水酸化也有可能會導致藻類生理調節機制發生變化（如電子傳遞、營養代謝、酶活等），引起負面效應[22]。因此，海水酸化對硅藻的影響取決于CO2濃度升高和pH 下降的正負效應的平衡。

pCO2降低和海水堿化會引起硅藻細胞碳酸酐酶活性的升高[23]，導致細胞消耗大量能量去維持碳酸酐酶的運轉，從而沒有足夠的能量去維持較高的生長速率。低pCO2水平也有可能導致硅藻合成碳骨架能力的降低[23]。前期研究表明硅藻的生長可能受到低pCO2水平的抑制或者不受pCO2水平變化的影響[11，24–25]，而也有研究發現表明低pCO2甚至可以促進菱形藻的生長，這可能是因為低pCO2條件下，菱形藻進行光合作用所利用 HCO?3的比例升高[26]。另外，胞外pH 升高可能導致細胞膜轉運H+的過程發生改變并消耗能量，或導致細胞氨基酸含量降低以及有機物質泄露[27]，從而影響細胞生長[28]。同時，還有研究發現較高的海水pH 可能會推動群落演替，受高pH 影響較小的物種如三角褐指藻將占優勢地位[29]。pH 變化還會影響硅藻細胞的細胞毒性，研究發現，擬菱形藻（Pseudonitzschia）的細胞毒性在高pH 條件下比酸化條件下高70 倍[30]。這些研究結果各不相同的原因可能是探究的pCO2水平不同或者是種間差異，也有可能是實驗中不同的碳酸鹽系統調控手段造成的。

盡管關于pCO2變化對浮游植物群落的生態效應已經有了大量的認識，但是在之前的研究中通常只設置1～2 個pCO2水平，而且大多聚焦于pCO2升高導致的效應，忽略了pCO2降低的影響。在本實驗中，我們 在7 個pCO2水 平（ 25 μatm、 50 μatm、 100 μatm、200 μatm、400 μatm、800 μatm、1 600 μatm）下培養斑點海鏈藻，研究海水酸化和堿化對其光合生理特性的影響，因為這種藻只利用海水中的CO2[18]，所以實驗能夠更好地反映pCO2變動導致的生理學效應，為預測近岸海水碳酸鹽系統變化對初級生產力的影響提供一定的數據支持。

2 材料與方法

2.1 培養條件

本實驗選取斑點海鏈藻（Thalassiosira punctigera）（CCAP 1085/19）為研究對象。培養條件設置溫度為20°C、光暗比12 h∶12 h、光強以光量子計為150 μmol /(m2·s)。實驗所用海水為高溫滅菌的人工海水[31]，營養鹽按f/2 培養基配方[32]進行加富。通過向未加DIC 的人工海水中加入不同量的NaHCO3將海水調成不同DIC濃度（見2.2 節）。將藻細胞培養在500 mL 的聚碳酸酯瓶（Nalgene，Thermo Scientific）中，采用半連續培養的方式，每48 h 稀釋1 次，培養過程中將藻細胞濃度控制在1 500 cell/mL 以下，以減小細胞代謝對海水碳酸鹽系統的影響。

2.2 實驗設置

本實驗設置7 個pCO2梯度，分別為25 μatm、50 μatm、100 μatm、200 μatm、400 μatm、800 μatm、1 600 μatm，藻細胞在7 個pCO2水平處理下適應10～15 代后測定其生理生化參數。在本實驗中，在密閉條件下，通過向無碳人工海水中加入經細菌過濾頭（孔徑：0.22 μm，Millipore Express）過濾滅菌的NaHCO3（CNaHCO3= 1 mol/L）使海水達到實驗設置的pCO2水平。加入NaHCO3的體積可以通過以下公式計算：

式中，目標DIC 根據實驗pCO2水平和總堿度（Total Alkalinity, TA）（TA 設 置 為2 300 μmol/kg）通 過CO2SYS 軟件計算得到。最后在密閉條件下加入HCl 或NaOH 將海水pH 調至CO2SYS 軟件計算得到的pH，pH 使 用3 點 校 準 的pH 計（FE20, Mettler Toledo）測定。每個處理3 個重復。

2.3 海水碳酸鹽系統參數測定

培養48 h 后，取100 mL 藻液，用細菌過濾頭（孔徑：0.22 μm，Millipore Express）過濾樣品后測定總堿度，總堿度根據Gran 滴定法測定[33]。根據TA 和pH使用CO2SYS 軟件計算海水中的其他海水碳酸鹽系統參數。

2.4 生長速率、細胞體積和表面積測定

生長速率根據48 h 內細胞濃度變化計算得到的日相對生長速率，生長速率（μ，單位：d-1）用以下公式計算：

式中，Nn和Nn?1分別 代表 第n次稀 釋前和第n– 1 次稀釋后的細胞濃度；?t表示相鄰2 次稀釋之間的時間間隔。

在本實驗中，通過顯微鏡和Toupview 軟件測量細胞的底面直徑（l）和高（h）。斑點海鏈藻的體積以及表面積使用圓柱體體積（V）和表面積（SA）公式計算[34]：

再根據V和SA的比值計算細胞比表面積V∶SA。

2.5 葉綠素a 含量和生物硅含量測定

取100 mL 藻液抽濾到GF/F 膜（直徑25 mm，Whatman）上，加入5 mL 無水甲醇提取葉綠素a，放在4°C 的冰箱中，避光過夜。測定葉綠素a含量時，將甲醇提取液放在高速冷凍離心機中離心（5 000 g，10 min），取出上清液測定。葉綠素a的測定使用紫外?可見光分光光度計（Lamda35，Perkin Elmer），測定632 nm、665 nm、750 nm 3 個波長的吸光度，葉綠素a（Chla）的濃度使用Ritchie[35]的公式計算：

式中，A632、A665和A750分別表示樣品在對應波長下的吸光度，公式計算所得結果再根據藻細胞濃度和藻液體積計算為單位細胞的葉綠素a濃度。

生物硅（BSi）測定時，取100 mL 的藻液，將其抽濾到混合纖維膜上，80°C 條件下烘干24 h。BSi 的測定使用Brzezinski 和Nelson[36]的鉬酸鹽顯色法，用濃度為0.2 mol/L 的NaOH 處理樣品40 min，然后加入濃度為1 mol/L HCl 中和。再加入鉬酸銨和還原劑反應后，使用分光光度計測定樣品在波長為810 nm 處的吸光度，通過標準品梯度稀釋建立標準曲線，計算樣品中BSi 含量，再根據藻細胞濃度和藻液體積計算得到單位細胞的BSi 含量。

2.6 葉綠素熒光參數測定

使用AquaPen-C（AP-C100，Photon Systems Instruments）葉綠素熒光儀測定葉綠素熒光參數。測定前，將藻液濃縮到一定體積（細胞濃度約為10 000～20 000 cell/mL），暗適應15 min 后，測定其光系統II 的最大量子產量（Fv/Fm）。然后測定其快速光響應曲線（RLCs），響應曲線中光強設置7 個梯度，光量子數分別為：10 μmol/（m2·s）、20 μmol/（m2·s）、50 μmol/（m2·s）、100 μmol/（m2·s）、300 μmol/（m2·s）、500 μmol/（m2·s）和1 000 μmol/（m2·s）?？焖俟忭憫€中相對電子傳遞速率（rETR）用下式[37]計算：

式中，PAR表示光化光強度；Y(Ⅱ)表示光系統II 的有效光化學量子產量?？焖俟忭憫€用下式進行擬合：

公式擬合得到的參數有最大相對電子傳遞速率（rETRmax）、表觀光能利用效率（α）以及飽和光強（Ik），Ik可以用如下公式[38]計算：

2.7 光合作用和呼吸作用測定

光合作用速率和呼吸作用速率使用液相氧電極（Oxygraph+, Hansatech）進行測定。測定時使用低溫恒溫水浴槽（DHX-2005，南京先歐儀器制造有限公司）將氧電極反應槽水溫控制在20°C。測定光合放氧速率時光強設置為150 μmol photons/（m2·s）（與培養條件相同），光源為鹵素燈，在黑暗條件下測定呼吸作用速率。將藻液添加到反應槽中，通過記錄反應槽中氧氣增加的速率和降低的速率來計算光合作用和呼吸作用速率。光合作用速率（Pn）和呼吸作用速率（Rd）使用以下公式計算：

式中，RateP和RateR分別表示記錄的放氧速率和耗氧速率；N表示測定時反應槽內細胞濃度。

2.8 數據處理

所有數據都用（平均值±標準偏差）表示。不同處理之間的顯著性差異用one-way ANOVA 分析，顯著性水平設置為0.05。數據的處理和分析使用軟件Origin 9.0 和SPSS 18 軟件。

3 結果

不同pCO2水平的海水，隨著pCO2水平的升高，海水總堿度沒有變化，pH 從（9.01 ± 0.01）降至（7.63 ±0.01），DIC、 HCO?3和CO2(aq) 濃度逐漸升高（表1）。

表1 不同pCO2 水平的海水的碳酸鹽系統參數Table 1 Carbonate chemistry parameters of different pCO2 levels

斑點海鏈藻的生長速率隨pCO2水平的升高呈現先升高后降低的趨勢（圖1），在pCO2400 μatm 水平下，細 胞 生 長 速 率 達 到 最 大，為（0.54 ± 0.05） d?1，25 μatm 處理下，細胞生長速率最低，為（0.10 ± 0.04 ）d?1，相比于400 μatm 處理下的藻細胞，生長速率降低了81%（p< 0.01）。pCO2水平為800 μatm 和1 600 μatm處 理下的細胞 生 長 速 率分別為（0.45 ± 0.20） d?1和（0.37 ± 0.05） d?1，與400 μatm 處理下的生長速率相比，分別下降了17%（p< 0.01）和32%（p< 0.01）。

圖1 斑點海鏈藻在不同pCO2 水平下的生長速率Fig. 1 Specific growth rates of T. punctigera at different pCO2 levels

不同pCO2水平處理的斑點海鏈藻細胞體積、表面積和單位表面積的生物硅含量沒有明顯變化（體積：31 630～37 543 μm3，表面積：6 136～6 979 μm2，單位表面積的生物硅含量：53～81 fmol/μm2），pCO2水平對斑點海鏈藻細胞比表面積也沒有顯著影響（表2）。

pCO2水平對斑點海鏈藻葉綠素a含量的影響與生長速率一致，都是隨著pCO2的升高而呈現出先升高后降低的趨勢。葉綠素a濃度的最大值也出現在400 μatm 時，為（74.98 ± 7.33）pg/cell（圖2）。適應pCO2水平為25 μatm 的斑點海鏈藻葉綠素a含量在本實驗7 個不同pCO2水平處理中最低，為（9.83 ± 8.43）pg/cell，僅為400 μatm 時的13%。當CO2濃度逐漸增高，超過400 μatm 時，葉綠素a含量逐漸降低。適應pCO2水平800 μatm 和1 600 μatm 的斑點海鏈藻葉綠素a含量，分別為（56.98 ± 4.46）pg/cell 和（48.14 ± 1.01） pg/cell，相比當前pCO2水平（400 μatm）分別降低24%（p= 0.02）和36%（p= 0.01）。

斑點海鏈藻的Fv/Fm、rETRmax和α在低pCO2水平（25～200 μatm）時隨pCO2升高而升高，在400～1 600 μatm處理下沒有顯著變化（圖3A 至圖3C）。與400 μatm相比，斑點海鏈藻的Fv/Fm在25 μatm 和50 μatm 處理下，分別降低了76%（p< 0.01）和29%（p= 0.01），在25 μatm 時 藻 細胞rETRmax相比 于400 μatm 處 理 降低了66%（p< 0.01），而α降低了69%（p= 0.01）。不同pCO2水平下，斑點海鏈藻的飽和光強沒有顯著差異（圖3D）。

表2 不同pCO2 水平的斑點海鏈藻的細胞體積、表面積、表面積與體積的比值和單位表面積的生物硅含量Table 2 Cell volume, surface area, surface area-to-cell volume ratio, and BSi content per surface area of T. punctigera cells grown at different pCO2 levels

圖2 斑點海鏈藻在不同pCO2 水平的葉綠素a 含量Fig. 2 Chlorophyll a content of T. punctigera at different pCO2 levels

斑點海鏈藻的光合作用速率隨著pCO2的升高也呈現出先升高后降低的趨勢。但是在酸化條件下（800 μatm、1 600 μatm），細胞的光合速率相比400 μatm處理沒有顯著性差異。當pCO2水平從25 μatm 升高到400 μatm 時，斑點海鏈藻的光合作用速率（以O2計）從（8.32 ± 0.44）pmol/(cell·h)升高到（22.13 ± 5.03）pmol/(cell·h)，增幅為166%（p= 0.01）（圖4A）。pCO2水平在25～100 μatm 的范圍內，呼吸作用速率隨著pCO2水平的升高而降低，從（27.54 ± 9.75）pmol/(cell·h)降至（13.54 ± 3.11） pmol/(cell·h)；隨著pCO2水平的繼續升高，呼吸作用速率呈現下降趨勢，但在100～1 600 μatm 范圍內沒有顯著性差異（圖4B）。

4 討論

在本實驗中，低pCO2水平對斑點海鏈藻的影響比高pCO2水平的影響更大，即海水堿化比酸化對斑點海鏈藻的影響更為顯著。在低pCO2水平（25～200 μatm）處理下，斑點海鏈藻的生長速率僅有400 μatm 下生長速率的18%～72%。同時光合作用速率、葉綠素a含量也受低pCO2水平影響較大。在海水酸化條件（800 μatm、1 600 μatm）下，斑點海鏈藻的生長速率為400 μatm 時的83%和69%，但光合作用沒有顯著變化，這些結果表明當前海水pCO2水平（400 μatm）比較適合斑點海鏈藻的生長，400 μatm 可能是海水pCO2升高對斑點海鏈藻光合生理影響的轉折點，海水堿化（25～200 μatm）和海水酸化（800 μatm、1 600 μatm）均會抑制其生理過程，且海水堿化對其影響更顯著。

pCO2水平從200 μatm 降低至25 μatm，斑點海鏈藻的生長速率、葉綠素a含量和光合作用速率逐漸降低，此時溶解的CO2和 HCO?3濃度降低，pH 升高 ，其中，CO2從（6.1 ± 0.1）μmol/kg 降至0.8 μmol/kg，HCO?3從（1 588 ± 35）μmol/kg 降至（827 ± 9） μmol/kg，pHNBS從（8.43 ± 0.01）升至（9.01 ± 0.01）。研究發現，斑點海鏈藻只能利用CO2[18]，在低pCO2水平下，細胞可利用的溶解性CO2較少，而溶解性CO2作為光合作用的直接底物，其濃度在25 μatm 時僅為0.8 μmol/kg，遠低于硅 藻Rubisco 的CO2半 飽 和 常 數20～60 μmol/kg[13]。雖然細胞可通過上調CCM 濃縮胞內CO2濃度，但是這一過程需耗費大量能量，因此分配到細胞分裂過程的能量變少。此外，較低的底物濃度會減少細胞的光合固碳量，即細胞分裂的物質基礎下降，這可能是低碳處理下細胞生長速率較低的原因。低碳條件下，葉綠素a含量降低會減小光系統的捕光面積，即細胞通過色素所捕獲的光能下降[39]，這些都反映了斑點海鏈藻受到了低碳限制。

圖3 在不同pCO2 水平下生長的斑點海鏈藻的最大光量子產量（A）、最大電子傳遞速率（B）、表觀電子傳遞速率（C）和飽和光強（D）相對400 μatm 處理的百分比變化Fig. 3 Percentage changes of maximum photochemical quantum yields (A), relative maximum electron transport rate (B), apparent photon transfer efficiency (C), and light saturation point (D) (%) of T. punctigera cells grown at different pCO2 levels relative to 400 μatm treatment

圖4 斑點海鏈藻在不同pCO2 水平的凈光合作用速率（A）和呼吸作用速率（B）Fig. 4 Net oxygen evolution (A) and dark respiration rates (B) of T. punctigera cells at different pCO2 levels

已有研究發現，低pCO2條件下，粒徑較小的浮游植物，細胞比表面積較大，擴散邊界層較薄，可以轉運更多的CO2，以緩解低碳對光合作用的限制[40]。但在本實驗中，斑點海鏈藻細胞在不同pCO2水平處理下比表面積沒有變化，可能無法緩解低碳對光合作用的限制。另一方面，Rubisco 可以催化兩種反應：氧化反應和羧化反應，在低pCO2水平下加氧反應理論上更具有優勢[41]，因此光合作用會被抑制，正如本實驗中所觀察到的較低的光合放氧速率。

研究表明，海洋酸化可能會對海洋初級生產者產生深遠的影響[42]。但是由于種間差異性和其他環境因子的影響[43?44]，海水pCO2水平升高可能會促進、抑制或不影響浮游植物的光合作用和生長速率[45–48]。在本研究中，酸化條件抑制了斑點海鏈藻的生長速率和葉綠素a含量。隨著海水pCO2水平（400～1 600 μatm）升高和pH 下降，酸性的增加可能導致斑點海鏈藻生理調節機制的變化，產生負面效應。在酸化條件下，細胞內的酸堿平衡被破壞，胞內光合作用相關的酶活性降低，生長速率降低[49]。研究發現，在高pCO2水平下，藻細胞光合基因的轉錄會受到抑制，與碳轉運和固定相關的幾種光合酶水平降低，葉綠素a含量降低，光合作用受抑制[50–51]。但酸化對斑點海鏈藻生長的影響并沒有堿化的影響顯著。在使用類似實驗方法、相同pCO2水平對硅藻威氏海鏈藻影響的研究[52]中發現，在酸化條件下，威氏海鏈藻的生長不受影響。這可能是由它們的種間差異造成的，不同粒徑的硅藻對pCO2水平變化的適應能力不同[53]。這與之前發現的研究一致，小粒徑（< 20 μm）的硅藻對海洋酸化的耐受能力更強，而大粒徑（> 20 μm）的硅藻對海洋酸化的耐受能力較低，在未來長期海洋酸化的背景下，浮游植物群落中，大粒徑的硅藻豐度將下降，而小粒徑的硅藻豐度將升高[54]。但也有研究顯示，海洋酸化時，pCO2水平的增加會減小細胞生長所需的碳和擴散到細胞表面的CO2之間的差額，大粒徑的硅藻可能因此而受益[55]。因此，硅藻對海洋酸化的響應機制需要進一步的研究。

在近岸海域，海水碳酸鹽系統震蕩劇烈，海水pH日變化較大，有些地區海水pH 日變化甚至會超過1 個單位[6]。因此，對pH 變化適應能力的強弱將決定近岸海域浮游植物群落的結構和初級生產力的變化[56]。威氏海鏈藻和斑點海鏈藻對低pCO2水平的響應一致，但對高pCO2的響應差異較大，因此，未來海水中威氏海鏈藻和斑點海鏈藻的相對豐度可能發生變化。本研究結果有助于加深對近岸浮游植物在環境變化條件下競爭能力以及地理分布的理解，對探究近岸浮游植物如何適應動態環境變化具有一定的生態學意義。

值得注意的是，在本實驗中，由于實驗條件所限，我們只研究了斑點海鏈藻對不同pCO2水平的短期響應，而沒有考慮斑點海鏈藻對不同pCO2水平的進化適應。不同類群的浮游植物對長期和短期海洋酸化表現出不同的適應機制，在藍藻和顆石藻中發現，無論酸化處理時間如何，其生長都受到酸化的促進[57–58]。但也有研究表明，在長期（1800 代）和短期（20 代）處理下，硅藻三角褐指藻的生長和光合作用對海水酸化的響應截然相反[59]。因此，在研究未來海洋環境變化對浮游植物影響時，還應考慮其進化適應。