袁 哲,尹燕杰 ,馬宏宇
(哈爾濱市食品藥品檢驗檢測中心,哈爾濱150525)
肝素鈉系自豬腸黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽,是由不同分子質量的糖鏈組成的混合物.肝素鈉注射液為肝素鈉的滅菌水溶液,輔料包括注射用水、氯化鈉,個別生產廠家會在生產過程中加入一定量的苯酚.苯酚是注射劑中常用的抑菌劑,同時也是世界公認的致癌物質.一方面,苯酚含量過低無法保證制劑質量;另一方面含量過高又會對人體產生危害.肝素鈉注射液現行質量標準收載于《中國藥典》2015年版二部[1],但其標準中并未對可能添加的苯酚成分進行檢測.本文通過參考相關文獻[2-12]建立了HPLC法測定肝素鈉注射液中含苯酚的量,為其質量標準提高提供依據.
Waters 2695-2998高效液相色譜儀;Mettler電子天平XS105.苯酚對照品(批號100509-201804,體積分數為100%),中國食品藥品檢定研究院;甲醇(色譜純),實驗用水為Milili-Q純水機制備.肝素鈉注射液(A廠家生產,規格2 mL,批號:1607319)、肝素鈉注射液(B廠家生產,規格2 mL,批號:51709106)、肝素鈉注射液(C廠家生產,規格2 mL,批號:1703103)
Agilent C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為甲醇-水(60∶40);流速1.0 mL·min-1;檢測波長270 nm;柱溫30 ℃,進樣量10 μL.
2.2.1 對照品貯備液
對照溶液(1) 精密稱取苯酚對照品26.59 mg置5 mL量瓶中,加水溶解定容至刻度,搖勻,即得.
對照溶液(2) 精密稱取苯酚對照品74.92 mg置25 mL量瓶中,加水溶解定容至刻度,搖勻,即得.
對照溶液(3) 精密稱取苯酚約10 mg置100 mL量瓶中,加水溶解并定容至刻度,搖勻,即得.
2.2.2 供試品溶液
精密吸取供試品1.0 mL置25 mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,即得.
精密吸取對照溶液(1)100 μL置10 mL量瓶中,用水稀釋并定容至刻度,搖勻.吸取10 μL進樣,在該色譜條件下,苯酚的保留時間約為6.1 min,理論塔板數大于10 000,拖尾因子為1.10,峰面積RSD為0.10%(n=7);在被測的三個廠家的樣品色譜圖中,苯酚與相鄰雜質峰的分離度均大于1.5,其他組分峰均不干擾苯酚的測定,專屬性較好,典型色譜圖見圖1 .
圖1 專屬性HPLC圖
2.4.1 線性關系考察
精密吸取對照溶液(1)50、100、200、400、600、800 μL分別置10 mL量瓶中,用水稀釋至刻度.再分別吸取10 μL進樣,記錄色譜圖.以苯酚的質量濃度為橫坐標X,峰面積為縱坐標Y,求得回歸方程為:
Y=1.0×107X-1.314×104r=1
結果表明,苯酚在26.59~425.44 μg·mL-1質量濃度范圍內,峰面積與質量濃度呈良好的線性關系.
2.4.2 精密度試驗
取苯酚對照溶液(3),連續進樣6次,主峰面積的RSD=0.87%,保留時間的RSD=0.12%,表明儀器的精密度良好.
2.4.3 重復性試驗
取供試品(1703103)照上述“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液6份,按“2.1”項下的色譜條件進行測定,以外標峰面積法計算含苯酚量.結果苯酚的平均質量濃度為2.47 mg·mL-1,RSD=0.36%,表明此方法的重復性良好.
2.4.4 穩定性試驗
將供試品溶液(1703103)放置于室溫,分別在0、2、4、6、8、12 h六個時間點,按上述“2.1”項下的色譜條件,分別進樣并計算含苯酚的量,結果平均質量濃度為2.46 mg·mL-1,RSD=0.20%,表明供試品溶液在室溫放置12 h內穩定.
2.4.5 回收率試驗
分別精密吸取苯酚對照溶液(2)0.8、1.0、1.2 mL,各3份,分別置于25 mL量瓶中,再依次加入已知不含苯酚的肝素鈉注射液1.0 mL,加水稀釋并定容至刻度,設為低、中、高三個組,按“2.1”項下的色譜條件,分別計算每組的回收率(n=9).結果樣品的平均回收率為99.23%,RSD為0.51%.結果見表1.
表1 回收率(n=9)
按“2.1”項下的色譜條件,取對照溶液(3)及供試品溶液分別進樣,按外標峰面積法,計算苯酚的標示百分含量,結果見表2.
表2 肝素鈉注射液中含苯酚的量
《中國藥典》2015年版四部注射劑通則中規定,靜脈給藥注射液不得添加抑菌劑[13].但由于一些制劑的不穩定性,在其生產中可能會加入一定量的抑菌劑.抑菌劑在保證人體安全性的前提下,對制劑在貯存、應用過程中的制劑質量起到很大的作用.目前苯酚的測定方法很多,原料藥采用的是溴量法,還有采用紫外法、氣相色譜法等[2].本文建立了高效液相色譜法,以甲醇-水(60∶40)為流動相,測定肝素鈉注射液中含苯酚的量.通過對市售三個廠家的樣品測定發現,藥品說明書中未標注添加了苯酚的品種,經檢測均未檢出苯酚.其中一個廠家標注了每100 mL中含苯酚0.25 g,經檢測其含量為標示量的98.4%.經方法學考察,本方法簡便、準確,可用于肝素鈉注射液中苯酚的測定.