基于TCGA數據庫分析PODNL1基因在腎透明細胞癌中的表達及臨床價值

丁 億，熊世達，鄧 文，何文瑞，郭 炬

(南昌大學a.研究生院醫學部2019級；b.研究生院醫學部2018級;c.第一附屬醫院泌尿外科，南昌 330006)

腎細胞癌是來源于腎小管上皮細胞的異質性癌癥，占所有癌癥發病率的3%～5%[1]，其組織學亞型有腎透明細胞癌(kidney renal clear cell carcinomas，KIRC)、腎乳頭狀細胞癌和腎嫌色細胞癌。KIRC為主要的組織學亞型，約占所有腎癌患者的70%～75%[2]。臨床上大多數KIRC患者對長期使用化療或放療易產生耐受，故手術切除是其目前的主要治療方法。此外，約有1/3的KIRC早期確診患者伴有局部或遠處轉移，故雖經手術治療達到臨床治愈，仍約有1/4的患者在術后隨訪中發生遠處復發[3-5]。KIRC患者的復發和轉移與其不良預后相關[2,6]，因此，尋找新的有效的分子標記物，對改善患者的預后具有重要意義。

有研究[7]指出，Podocan樣1(PODNL1)蛋白具有信號肽，1個富含半胱氨酸的N端簇，21個富含氨基酸的重復基序和1個假定的N-糖基化位點，在蛋白結構上類似于Podocan的蛋白，是富含亮氨酸的小重復蛋白聚糖(SLRPs)家族的成員之一。有研究[8]發現，PODNL1在神經膠質瘤中高表達并且能夠影響其生物學功能。然而，關于PODNL1在KIRC中的表達、與臨床預后的相關性及分子機制目前尚未見報道。因此，本研究通過數據挖掘癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫，分析PODNL1在KIRC中的表達和預后價值，并利用基因集富集分析(GSEA)預測其可能的分子機制，旨在為KIRC篩選可靠的分子靶標提供線索和依據。

1 資料與方法

1.1 資料來源

從TCGA數據庫(http://www.tcga.org/)中下載KIRC的mRNA數據和相關共獲得KIRC患者組織樣本539例，正常組織樣本72例作為對照。使用R 4.0.4軟件提取PODNL1在KIRC組織和正常組織中的表達情況，通過WilCox檢驗比較2組PODNL1的表達；采用WilCox檢驗對72對KIRC組織和正常組織中的PODNL1的表達進行配對差異分析。此外，從下載的臨床數據中分別提取患者的臨床資料，包括年齡、性別、生存時間、生存狀態、腫瘤分級、臨床分期、TNM分期。

1.2 方法

1.2.1 PODNL1的表達及其與KIRC患者預后關系的分析

根據PODNL1表達在KIRC組織中表達的中位值，將KIRC患者分為2組：高表達組和低表達組。利用R軟件，通過WilCoxon符號秩檢驗和邏輯回歸分析PODNL1基因表達與患者臨床參數的關系，包括腫瘤分級、臨床分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結浸潤、遠處轉移；采用Kaplan-Meier生存分析2組的總體生存率(overall survival，OS)，采用單因素和多因素Cox回歸分析與患者預后相關的臨床因素，并分析PODNL1基因在KIRC預后評估中的價值。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測PODNL1基因在各細胞系中的mRNA表達水平

體外培養正常腎小管上皮細胞系HK2和KIRC細胞系A-498、786-O、ACHN、OSRC-2，細胞/組織中總RNA提取試劑(諾唯贊生物科技公司)提取細胞總RNA，HiFiScript cDNA Synthesis Kit(康為世紀生物科技公司)將其逆轉錄為cDNA，SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)(賽維爾生物科技公司)進行擴增，采用2-△△Ct方法對估計值進行驗證。PODNL1基因引物序列為上游引物：3′-CAACGGTGCTGTGACTCTG-5′；下游引物：3′-CCCTGCCCATGTACCCT-5′。ACTIN引物序列為上游引物：3′-TCTCCCAAGTCCACACAGG-5′；下游引物：3′-GGCACGAAGGCTCATCA-5′。

1.2.3 基因富集分析

基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)是一種在基因集的水平上研究微陣列數據的計算方法[9]。在本研究中，GSEA被用來確定PODNL1高表達組與低表達組之間的差異。以PODNL1表達作為表型標記，利用GSEA 4.1.0軟件進行KEGG通路富集分析，并將隨機組合次數設置為1000次。以標準化富集分數(NES)的絕對值大于1，正常P<0.05和錯誤發現率小于0.25的基因集為富集標準。

1.2.4 統計學方法

使用R 4.0.4軟件進行數據處理。使用WilCox檢驗分析PODNL1在KIRC組織和正常組織中的表達差異；WilCoxon符號秩檢驗和邏輯回歸分析PODNL1與患者臨床病理參數的關系；生存分析使用Kaplan-Meier方法；使用單因素Cox回歸分析總生存率(OS)與臨床相關因素之間的關系；采用多因素Cox分析，篩選獨立預后因素。用t檢驗比較PODNL1基因在KIRC細胞系和正常細胞系中的表達差異。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PODNL1在KIRC組織和細胞系中的表達

與正常組織比較，PODNL1在KIRC組織中的表達顯著上調(P<0.001)。見圖1A。72對配對的KIRC組織和正常組織中PODNL1表達分析亦顯示，PODNL1基因在KIRC組織中的表達顯著上調(P=0.003)。見圖1B。RT-qPCR結果顯示，與HK2細胞比較，4種癌細胞系中PODNL1的mRNA相對表達量均更高，差異具有統計學意義(均P<0.05)。見圖2。

A：PODNL1基因在腎臟正常組織和KIRC組織中的表達比較；B：72對配對的KIRC組織和癌旁組織中PODNL1的表達比較。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與HK2細胞比較。

2.2 PODNL1的表達與KIRC患者臨床病理參數的關系

PODNL1在KIRC患者中的表達與腫瘤分級(P<0.001)、臨床分期(P<0.001)、腫瘤浸潤深度(P<0.001)、淋巴結浸潤(P=0.001)、遠處轉移(P=0.001)均顯著相關。見圖3。邏輯回歸分析結果亦顯示PODNL1表達與臨床病理參數顯著相關。見表1。

A：腫瘤分級(grade)；B：臨床分期(stage)；C：腫瘤浸潤深度(T)；D：淋巴結轉移(N)；E：遠處轉移(M)。

表1 PODNL1表達與KIRC患者臨床病理參數的關系

2.3 PODNL1表達與患者OS、預后的關系

Kaplan-Meier生存分析結果(圖4A)顯示，KIRC組織中高表達組的總體生存率顯著低于低表達組(P<0.001)。單因素Cox回歸分析結果顯示，PODNL1的表達、年齡、腫瘤分級(grade)、臨床分期(stage)、TNM分期與患者的生存相關(均P<0.05)；多因素Cox回歸分析結果顯示，年齡、腫瘤分級(grade)和PODNL1表達均可作為KIRC預后的獨立風險因子。見表2。

表2 單因素和多因素Cox回歸分析

圖4 PODNL1表達與KIRC患者OS的關系

2.4 GSEA富集分析

GSEA富集分析結果顯示，在PODNL1高表達組中，篩選出了9條與細胞黏附和腫瘤發生相關的重要信號通路顯著上調，包括細胞外基質受體相互作用、鈣信號通路、局部性粘連、Hh信號通路、P53信號通路，NOTCH信號通路、MAPK信號通路、VEGF信號通路和腫瘤相關通路。見圖5。

圖5 GSEA富集分析KIRC中PODNL1高表達激活的信號通路

3 討論

富含亮氨酸重復序列的小分子蛋白聚糖家族(SLPRs)是蛋白聚糖的一個特殊亞群，參與細胞生長和信號傳導的關鍵調節劑[10]。SLPRs廣泛存在于細胞外基質中，在各種癌癥中具有潛在的調控腫瘤細胞增殖、血管生成和遷移的作用[11-12]。而Podocan樣1(PODNL1)蛋白作為SLRPs的V類成員[13]，2011年首次被發現其存在于成骨細胞和新形成的骨骼中[7]。近年來，PODNL1在腫瘤的發生發展中的作用被不少研究者關注。例如，TENG等[14]指出PODNL1可作為卵巢癌預后的生物標記物。在神經膠質瘤中PODNL1的表達與患者的預后呈負相關，并可通過調節Akt/mTOR途徑促進神經膠質瘤細胞增殖、遷移[8,15-16]。

本研究基于TCGA數據庫的分析發現，PODNL1基因在KIRC組織中表達顯著上調；同時，本研究發現PODNL1基因的mRNA表達水平在正常腎小管上皮細胞系顯著低于腎癌細胞系。此外，PODNL1的表達與KIRC患者的腫瘤分級、臨床分期和TNM分期相關，提示PODNL1參與KIRC的惡性進展；PODNL1的表達與患者的總體生存率呈負相關，單因素和多因素Cox回歸分析表明PODNL1是KIRC的獨立預后因子，提示PODNL1與患者的預后有關。而且，利用TCGA數據庫下載的數據進行GSEA富集分析，結果發現多個腫瘤相關通路在PODNL1高表達組織樣本中均有不同程度的富集。其中，細胞外基質受體相互作用已經證明參與包括腎癌在內的多種癌癥細胞的增殖和侵襲[17]；NOTCH信號通路異常激活后參與維持KIRC的干性功能特性[18]；抑制VEGF途徑是轉移性KIRC的分子靶向治療的關鍵點之一[19]。盡管PODNL1與這些腫瘤信號通路的關系尚未明確，但GSEA富集分析結果提示PODNL1高表達可能是促進腎癌細胞增殖和KIRC惡性進展的重要因子。此外，雖然通過上述生物信息學分析顯示PODNL1基因是KIRC的獨立預后分子標記物，但二者之間的確切關系及PODNL1與KIRC的作用與機制，仍需通過臨床前和臨床實驗進行驗證。

綜上所述，PODNL1基因在KIRC組織中呈高表達，并與KIRC的惡性進展相關，可能是預測患者預后的分子標記物。