妊娠對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的免疫調節作用

張洪連，周鑫華，謝 琛，江建香，梅竹君，劉詩英，胡 凡，曹文鋒

(江西省人民醫院、南昌大學附屬人民醫院神經內科,南昌 330006)

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種免疫介導的具有遺傳易感性的中樞神經系統慢性炎性脫髓鞘性疾病，具有時間多發、癥狀多發及空間多發的臨床特點。流行病學顯示MS發病率存在性別差異，全世界男女比例大約為1：2，青春期該比例增至1：4，導致這種性別差異的原因可能為基因易感性、免疫反應性別差異及體內性激素差異等[1]。MS發病高峰期為20～40歲，目前國外學者開展了一些回顧性及前瞻性的臨床研究發現妊娠期MS患者的病情進展及復發情況與非妊娠期比較存在差異，但這種差異在不同臨床試驗的研究結論中存在不一致性[2-4]，故至今妊娠對MS疾病的影響還不明確。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是模擬人類MS的經典動物模型，病理基礎都是主要活化CD4+T細胞參與免疫損傷的[5]。因此，本文擬研究妊娠后EAE小鼠的神經功能缺失及體內免疫系統的變化情況，為臨床上探究妊娠對女性MS患者疾病影響提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設備

完全弗氏佐劑FCA(上海源葉生物科技有限公司)；不完全弗氏佐劑FICA(美國Sigma公司)；Pertussis toxin(百日咳毒素)(美國List labs公司)、MOG35-55(生工生物工程(上海)股份有限公司)；熒光標記的細胞表面單克隆抗體FITC-CD4、APC-CD25、PE-Foxp3(美國Biolegend公司)；小鼠IFN-γ、IL-17、IL-10的ELISA檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，蘇木素染液(北京中杉金橋生物技術有限公司)；伊紅染色液(北京Solarbio公司)，Scott藍化液(北京Solarbio公司)，焦油紫(美國New Jersey公司)，Luxol fast blue(美國Sigma公司)，高清晰度彩色醫學圖像分析系統(武漢千屏影像技術有限責任公司)，光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 實驗動物

C57BL/6J鼠30只，雌性，6～8周齡(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2009-0004)；C57BL/6J鼠10只，雄性，3月齡(上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部，許可證號：SCXK(滬)2018-0006)。飼養條件：溫度20～26 ℃，濕度40%～70%。SPF級繁殖飼料飼養。

1.3 EAE小鼠模型的制作

雌性小鼠適應性培養1周后，于背部兩側皮下注射誘導EAE的抗原乳劑，0.2 mL·只-1，MOG35-55多肽劑量為300 μg·只-1。最后腹腔注射百日咳毒素，300 ng·只-1；48 h后再次腹腔注射百日咳毒素400 ng·只-1。建模成功雌性EAE小鼠30只。

1.4 實驗分組

注射完第2針百日咳毒素后第11天雌雄小鼠按2:1比例合籠受孕，次日檢查是否形成陰道栓來評估是否受孕，見栓日定為妊娠第1天。以成功妊娠的小鼠為妊娠組(n=10)；未配孕的小鼠為對照組(n=10)。若妊娠組小鼠死亡，則重新選取雌鼠建模、受孕。

1.5 神經功能評分

采用5分評分法對妊娠后EAE小鼠進行神經功能評分，評分時間點為妊娠后第1、4、7、10、13天(即建模后第12、15、18、21、24天)。評分細則為:0分，無癥狀；1分，輕度步態笨拙或尾部張力降低；2分，中度姿態異?；蜃藨B維持缺乏或尾部無張力;3分，肢體乏力；4分，肢體無力；5分，瀕死狀態或死亡。

1.6 ELISA法檢測

妊娠后第13天(妊中期)的EAE小鼠，摘除眼球收集血液，分離提取血清，按照ELISA試劑操作步驟檢測IFN-γ、IL-17、IL-10濃度，結果以ng·mL-1表示。

1.7 HE染色及Bielshowsky’s-Luxol fast blue staining雙染

采用脫臼法將妊娠第13天EAE小鼠處死，取腦和脊髓固定，包埋蠟塊，制作成切片，再將切片常規脫蠟并水化后，進行HE染色及Bielshowsky’s-Luxol fast blue staining雙染，分別觀察腦和脊髓病灶區炎癥細胞的浸潤及神經纖維脫髓鞘情況。

HE染色切片半定量評估方法如下：未見或偶見炎癥細胞浸潤為0分；僅血管周圍和脊髓膜有炎癥細胞浸潤為1分；腦或脊髓內有少量炎癥細胞浸潤為2分；腦或脊髓內中量炎癥細胞浸潤為3分；腦或脊髓內大量炎癥細胞浸潤為4分。

1.8 流式細胞術

采用流式細胞術檢測脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比。分離出EAE小鼠脾臟，研磨提取出淋巴細胞，反復洗滌干凈后收集淋巴細胞，加入FITC標記的CD4抗體和APC標記的CD25抗體，孵育60 min后將細胞重懸，并加入固定和通透液，孵育30 min后加入PE標記的Foxp3抗體，繼續孵育30min，洗滌上機檢測。用CD4+細胞進行門控，檢測CD25+Foxp3+Treg細胞百分比。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 神經功能評分比較

EAE小鼠大約在免疫后第11天開始出現癥狀，首要癥狀主要為尾部張力下降，癥狀逐漸加重，出現步態不穩、肢體無力等。如圖1所示，妊娠前2組間的神經功能評分比較無差異，但隨著發病時間延長，雖然兩組的EAE小鼠神經功能評分均呈進行性增加，但妊娠組與對照組比較更低，且在妊娠后第10、13天差異有統計學意義(P<0.05)。

妊娠后時間/d

2.2 血清IFN-γ、IL-17、IL-10水平

妊娠組EAE小鼠血清中IL-10水平為(56.89±7.45)ng·mL-1，高于對照組的(43.78±6.95)ng·mL-1(P<0.05)；IL-17水平[(455.42±23.81)ng·mL-1]與對照組[(516.22±24.76)ng·mL-1]比較顯著降低(P<0.05)；且IFN-γ水平[(920.12±45.65)ng·mL-1]與對照組[(1073.67±71.23)ng·mL-1]比較也顯著降低(P<0.05)，見圖2。

*P<0.05。

2.3 炎癥細胞的浸潤情況

妊娠組和對照組的EAE小鼠脊髓實質內都有少到中量的炎癥細胞浸潤，并可見血管周圍呈袖套樣炎癥細胞浸潤(圖3A—B)，且妊娠組脊髓病灶區炎癥細胞半定量得分為(2.33±0.24)分，低于對照組的(3.21±0.47)分(P<0.05)，見圖4。

A：妊娠組；B對照組。箭頭所示為袖套樣炎癥細胞。

2.4 神經纖維脫髓鞘情況

將腦和脊髓組織切片采用雙染方法染色后髓鞘染成藍色，軸索染成黑色；且妊娠組和對照組EAE小鼠的腦和脊髓白質內均可見神經脫髓鞘改變，但妊娠組的脫髓鞘程度較對照組輕，見圖5。

A：妊娠組；B：對照組。箭頭所示為神經脫髓鞘。

2.5 CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞數百分比

妊娠組EAE小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞數百分比為(9.63±0.47)%，高于對照組的(5.73±0.39)%(P<0.05)，見圖6。

圖6 2組CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞數百分比比較

3 討論

妊娠是育齡期女性最重要的任務之一，但作為MS的高發人群，處于妊娠期時MS女性患者其臨床癥狀如何變化目前仍不明確。RUOLLET等[2]在1993年首次針對這個問題進行了研究，未發現妊娠期復發率減低，但分娩后3個月內復發率比妊娠前升高了3倍，同時發現有過妊娠史的MS患者總體復發率低于無妊娠史者。CONFAVREUX等[3]分析MS患者妊娠前1年、妊娠期、分娩后1年的復發情況，發現MS患者懷孕期復發風險下降，尤其是孕晚期，但分娩后3個月內復發率顯著增加，然后逐漸恢復懷孕前狀態。FARES等[4]的試驗結果顯示在懷孕期和分娩后第1年MS無復發，但分娩后第2年復發率稍增加，第3年后復發率回歸于普通MS患者。根據目前臨床試驗結果提示妊娠時MS女性患者的復發率呈降低趨勢，并且還存在妊娠早、中晚期及分娩后的差異。同時有少量國外學者采用EAE小鼠模型進行了相關動物實驗研究，GEIKO等[6]發現妊娠期EAE大鼠模型其神經功能缺失評分明顯低于對照組。GATSON等[7]研究發現妊娠期的EAE小鼠模型通過低表達TNF-a、IL-17等炎性因子減輕中樞神經系統炎癥反應繼而使其神經功能緩解。本實驗同樣研究發現妊娠中期(妊娠周期為20～21 d，第13天處于妊娠中期)EAE小鼠的神經功能缺失癥狀與對照組比較減輕。結合目前臨床和動物實驗結果提示妊娠期MS/EAE的復發率呈下降趨勢，臨床癥狀相對較輕。

MS妊娠期復發率下降及臨床癥狀相對緩解的作用機制目前仍不確定。目前研究發現可能機制為妊娠期母體激素包括雌激素、孕激素及雄激素大量合成后具有免疫調節和神經保護作用[8-11]。MS是主要以CD4+Th1參與的細胞免疫為主的自身免疫性疾病，研究發現妊娠期母體高濃度雌激素能促使Th1型細胞免疫體系向Th2型體液免疫的明顯偏倚，繼而抑制促炎性Th1/Th17細胞的活化，從而下調MS患者Th1介導的慢性炎癥級聯反應，減輕中樞神經脫髓鞘和神經退行性改變[12]，本研究采用組織學染色同樣發現妊娠期EAE小鼠脊髓實質的脫髓鞘病理變化較對照組減弱。

調節性T細胞(Treg細胞)通過抑制機體內潛在的自身反應性T細胞的活化與增殖，從而維持機體的免疫耐受[13]。Treg細胞能調節Th1、Th2及Th17免疫細胞的整體平衡，從而降低IFN-γ和IL-17等促炎性細胞因子的分泌，緩解MS/EAE臨床癥狀[14]。同時激活的Treg細胞可分泌IL-35和IL-10等抗炎性細胞因子，具有免疫抑制功能，繼而調節免疫反應和避免免疫反應過度，故Treg細胞數量升高有利于自身免疫性疾病的病情緩解[9,15]。本實驗發現與對照組比較，妊娠期EAE小鼠脾臟內CD4+CD25+Treg細胞數百分比顯著增多，且血清中促炎性因子IFN-γ、IL-17降低和抗炎性細胞因子IL-10升高，而且采用HE染色進一步發現妊娠EAE小鼠脊髓實質內炎癥細胞浸潤程度減弱。因此，妊娠期MS/EAE的免疫系統可能通過分化和激活更多的Treg細胞來發揮其免疫調節和神經保護作用。

綜上所述，妊娠期EAE的臨床癥狀改善、中樞神經系統的炎癥反應和脫髓鞘程度減輕；其可能的作用機制為增加機體分化更多的Treg細胞，并提高其分泌抗炎性細胞因子IL-10的能力，同時抑制促炎性細胞因子IFN-γ、IL-17的分泌。本實驗結果為后期研究提供一定的動物實驗依據。