miR-196a通過靶向NR6A1降低宮頸癌Hela細胞生存和運動能力

梁 燕，朱萬嬌，張志蘇，許 紅，張 健

(1.襄陽市中心醫院/湖北文理學院附屬醫院婦科，湖北 襄陽 441021;2.荊州職業技術學院附屬醫院婦科，湖北 荊州 434020)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，也是導致發展中國家女性死亡的主要原因[1-2]。據統計，全球宮頸癌患者超過50萬，其中80%的患者來自發展中國家[3-4]。手術和放化療仍是治療宮頸癌的主要方法，但二者均不能有效降低宮頸癌的致死率。因此，探究宮頸癌的發生發展機制、尋找根治宮頸癌的方法是目前的研究熱點。有研究表明，微小型RNA(microRNA，miRNA)在癌癥中的異常表達及其對下游靶蛋白表達的調控在癌癥的發生發展過程中發揮了重要作用，既可誘導癌癥的發生發展又能抑制癌癥的惡化[5]。miR-196a是一類具有抑癌和誘導癌癥發生發展雙向作用的miRNA。研究顯示，miR-196a在乳腺癌細胞中呈低表達狀態，上調miR-196a表達能顯著抑制癌細胞的侵襲和遷移[6]。而miR-196a在宮頸癌細胞中呈高表達狀態，下調miR-196a表達可抑制宮頸癌細胞增殖[7]。NR6A1是一類生殖細胞核因子，在胚胎發育過程中具有重要作用[8]。有研究表明，NR6A1在腫瘤細胞中呈高表達狀態，可能與癌癥的發生發展密切相關，并且生物信息預測表明NR6A1可能是miR-196a的下游靶標[9]。但miR-196a能否通過調控NR6A1的表達影響宮頸癌的發生發展還未見報道。因此，本研究以宮頸癌Hela細胞為研究對象，探究miR-196a與NR6A1的靶向關系及其對宮頸癌Hela細胞生存和運動能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

細胞培養液RPMI 1640和胎牛血清購自美國Gibco公司。反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒、熒光素酶報告試劑盒和Lipofectamine 2000TM均購自美國Invitrogen公司。TRIzol試劑盒、BCA試劑盒和RIPA裂解液購自北京索萊寶生物科技公司。CCK8試劑盒和Annexin V-FITC購自美國ThermoFisher生物公司。GAPDH、NR6A1、Ki-67、MMP-9、Caspase-3和VEGF一抗購自美國CST公司，二抗購自美國Santa Cruz公司。miR-NC、miR-196a inhibitor、mimic-NC、miR-196a mimic和pcDNA- NR6A1均由美國Invitrogen公司設計合成。

1.2 細胞來源及培養

正常宮頸上皮HcerEpic細胞和宮頸癌Hela細胞、CaSki細胞由中國科學院上海細胞庫提供。將上述細胞接種于培養瓶或培養板中，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，隔天換液，2～3 d傳代1次，細胞傳代密度為1×104/mL，取第3～5代細胞進行實驗。

1.3 RT-PCR檢測miR-196a和NR6A1 mRNA表達

用TRIzol試劑盒提取正常宮頸上皮HcerEpic細胞和宮頸癌Hela細胞、CaSki細胞的總RNA，用反轉錄試劑盒合成cDNA，并用PCR儀進行擴增。根據熒光定量試劑盒說明書對cDNA進行定量分析，miR-196a以U6為內參，NR6A1以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算miR-196a和NR6A1相對表達水平。反應程序:95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個循環。實驗所用引物均采用Primer 5進行設計，由上海生工合成。NR6A1正向引物5’-GGGATGAACCGGAAGGCTATC-3’，NR6A1反向引物5’-GGCTGGTTGCTCTCCGAAG-3’；miR-196a正向引物5’-CCGACGTAGGTAGTTTCATGTT-3’，miR-196a反向引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；U6正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACAR-3’；U6反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；GAPDH正向引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，GAPDH反向引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCA-3’。

1.4 細胞轉染

根據說明書用Lipofectamine 2000TM將miR-NC、miR-196a inhibitor、陰性對照質粒pcDNA、過表達質粒pcDNA-NR6A1、inhibitor +NR6A1轉染到Hela細胞中，分別命名為NC組、miR-196a inhibitor組、pcDNA組、pcDNA-NR6A1組、inhibitor+NR6A1組。Control組則僅加入Lipofectamine 2000TM。轉染6 h后將轉染液更換為正常細胞培養液進行培養，24 h后進行相應檢測。

1.5 熒光素酶報告實驗

利用生物信息預測網站預測NR6A1 3’UTR序列上miR-196a的結合位點，用PCR將結合片段進行擴增并插入到熒光素酶載體中，構建NR6A1野生質粒(NR6A1+wt)。隨后利用基因突變技術將NR6A1 3’UTR與miR-196a的結合位點突變并克隆到載體中，構建NR6A1突變質粒(NR6A1+mut)。用miR-196a mimic或其陰性對照mimic-NC聯合NR6A1野生質?；蛲蛔冑|粒轉染Hela細胞，根據熒光素酶基因報告試劑盒說明書檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.6 CCK8檢測細胞活性

將傳代至第3～5代的Hela細胞接種于96孔板內，并按照1.4項下方法轉染，各組連續培養1 d、2 d、3 d、4 d，每孔加入10L的CCK8試劑，于培養箱繼續培養24 h后用酶標儀檢測各組細胞吸光度，計算細胞增殖倍數。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡

轉染后約48 h收集各組細胞，PBS洗滌細胞，并用膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)染色，4 ℃避光孵育10 min,隨后上機檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%。

1.8 Transwell檢測細胞侵襲能力

將按照1.4項下方法轉染后的各組細胞接種到用基質膠包被的Transwell小室上層中，密度為1×106/mL，用無血清培養液進行培養，小室下層則加入正常培養液進行培養。連續培養24 h后用無菌棉簽擦去上層未穿膜細胞，0.5%結晶紫對下層遷移細胞進行染色，并進行計數統計。

1.9 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

實驗前1 d用記號筆于12孔板背面劃平行直線，至少有3條直線穿過每個培養孔。第2天將Hela細胞以5×104/mL的密度接種于12孔板內，并按照1.4項下方法轉染細胞，6 h后用10L槍頭垂直于培養板正面直線劃痕，并用PBS洗滌，0.5%結晶紫懸浮細胞，加入無血清培養液繼續培養24 h，顯微鏡下觀察細胞遷移情況，并計算細胞遷移率。

1.10 免疫印跡檢測NR6A1蛋白表達

按照1.4項下方法處理細胞48 h后，收集細胞,用RIPA裂解液提取各組細胞蛋白，用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。將蛋白濃度調平后用10% SDS-PAGE分離蛋白并轉移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗GAPDH(1∶1 000)、NR6A1(1∶1 000)、Ki-67(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)和VEGF(1∶1 000)于4 ℃封閉過夜。第2天用TBST洗去未結合一抗，加入山羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，加入化學發光顯色液于暗室曝光顯影。

1.11 統計學分析

2 結果

2.1 宮頸癌細胞中miR-196a和NR6A1 mRNA的表達

RT-PCR實驗結果表明，宮頸癌Hela細胞和CaSki細胞中miR-196a和NR6A1 mRNA表達量均明顯高于正常宮頸上皮HcerEpic細胞(P<0.01)，且以Hela細胞中miR-196a和NR6A1 mRNA表達量最高(P<0.05)，見圖1。因此，選擇Hela細胞進行后續實驗。

*：與HcerEpic組比較，P<0.01；#：與CaSki組比較，P<0.05圖1 miR-196a和NR6A1 mRNA在HcerEpic、Hela和CaSki細胞中的表達

2.2 miR-196a與NR6A1的靶向關系

與Control組比較，NC組Hela細胞NR6A1蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)，miR-196a inhibitor組NR6A1蛋白表達水平明顯較低(P<0.01)，提示miR-196a能調控NR6A1表達(圖2)。生物信息預測結果表明，NR6A1基因序列上有miR-196a的靶向結合位點；此外，熒光素酶報告實驗結果表明，miR-196a inhibitor能顯著降低NR6A1野生質粒的熒光素酶活性(P<0.01)，但對NR6A1突變質粒的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，提示miR-196a可靶向調控NR6A1表達(圖3)。

*：與Control組比較，P<0.01

*：與NR6A1 wt+miR-NC組比較，P<0.01

2.3 下調miR-196a表達對宮頸癌細胞增殖的影響

pcDNA-NR6A1能顯著提高Hela細胞中NR6A1蛋白表達水平(P<0.01)，見圖4，表明轉染成功；轉染細胞4 d后，與Control組比較，miR-196a inhibitor組細胞增殖倍數明顯較低(P<0.01)，pcDNA-NR6A1組細胞增殖倍數顯著較高(P<0.01)；與miR-196a inhibitor組比較，inhibitor+NR6A1組細胞增殖倍數顯著較高(P<0.01)，見圖5，表明miR-196a inhibitor能通過下調NR6A1表達抑制Hela細胞增殖。

*：與Control組比較，P<0.01

*：與Control組比較，P<0.01；#：與miR-196a inhibitor組比較，P<0.01圖5 miR-196a對Hela細胞增殖的影響

2.4 下調miR-196a表達對細胞凋亡的影響

流式細胞術實驗結果表明，miR-196a inhibitor能顯著提高Hela細胞凋亡率，pcDNA-NR6A1能顯著降低Hela細胞凋亡率，與Control組比較差異有統計學意義(P<0.05)；與miR-196a inhibitor組比較，inhibitor+NR6A1組細胞凋亡率明顯較低(P<0.01)，見圖6。免疫印跡實驗結果顯示，miR-196 inhibitor組Caspase-3表達較高，pcDNA-NR6A1組Caspase-3表達較低，與Control組比較差異有統計學意義(P<0.05),見圖7。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與Control組比較，P<0.01；△：與miR-196a inhibitor組比較P<0.01

*：與Control組比較，P<0.05；#：與Control組比較，P<0.01；△：與miR-196a inhibitor組比較，P<0.01

2.5 下調miR-196a表達對宮頸癌細胞侵襲及遷移能力的影響

與Control組比較，miR-196a inhibitor組侵襲細胞數明顯較少(P<0.01)，pcDNA-NR6A1組侵襲細胞數明顯較多(P<0.01)；與miR-196a inhibitor組比較，inhibitor+NR6A1組侵襲細胞數明顯較多(P<0.01)，見圖8。同時，miR-196a inhibitor組細胞劃痕閉合率顯著低于Control組(P<0.01)，pcDNA-NR6A1組細胞劃痕閉合率顯著高于Control組(P<0.05)；inhibitor+NR6A1組細胞劃痕閉合率顯著高于miR-196a inhibitor組(P<0.01)，見圖9。此外，miR-196a inhibitor還能顯著抑制Hela細胞中Ki-67、VEGF和MMP-9的表達(P<0.01)，pcDNA-NR6A1顯著促進Ki-67、VEGF和MMP-9的表達(P<0.05)，inhibitor+NR6A1能顯著減弱miR-196a inhibitor對Hela細胞中Ki-67、VEGF和MMP-9表達的抑制作用(P<0.01)，表明miR-196a可通過靶向上調NR6A1表達促進Hela細胞侵襲和遷移，見圖7。

*：與Control組比較，P<0.01；#：與miR-196a inhibitor組比較，P<0.01

*：與Control組比較，P<0.05；#：與Control組比較，P<0.01；△：與miR-196a inhibitor組比較，P<0.01

3 討論

miR-196a是一類位于脊椎動物HOX基因簇區域的miRNA，主要調控胚胎發育過程中同源轉錄因子的編碼，從而調控基因的遺傳表達[7,10]。近年來研究表明，miR-196a參與癌癥的發生發展。miR-196a在胃癌、胰腺癌及口腔癌細胞及組織中均呈高表達狀態，提示miR-196a可能具有致癌作用[11-13]。本研究發現，miR-196a在宮頸癌Hela細胞中的表達水平明顯高于正常宮頸上皮細胞，表明miR-196a可作為宮頸癌發生及惡化的指標。研究表明，miR-196a通過靶向LRIG3來促進子宮頸癌細胞的增殖和遷移[14]。本研究發現，miR-196a inhibitor能顯著降低宮頸癌Hela細胞的增殖倍數及細胞增殖蛋白Ki-67的表達，還能顯著增加癌細胞凋亡率，提高凋亡相關蛋白Caspase-3的表達，并抑制癌細胞侵襲和遷移，進一步表明miR-196a在宮頸癌中發揮著致癌作用，但其具體的作用機制有待進一步探討。

一項研究表明，miRNAs主要通過與靶向蛋白基因3’-UTR段結合調控靶向基因轉錄[15]。因此，探討miR-196a的靶向基因是了解miR-196a在宮頸癌中致癌作用機制的關鍵。在上皮性卵巢癌中，miR-196a可通過靶向下調HOXA10的表達促進卵巢癌SKOV3細胞侵襲和遷移[16]；在頭頸部鱗狀細胞癌中，miR-196a可通過下調IκBα表達促進膠質母細胞瘤的癌細胞增殖、侵襲和遷移，并誘導癌細胞上皮間質轉化的發生及放療抵抗的形成[17]；Feng等[18]的研究表明，miR-196a可通過靶向SFRP1促進胃癌細胞侵襲和轉移；Villegas-Ruiz等[19]的研究表明，miR-196a還可通過抑制HOXC8影響宮頸癌細胞的增殖。每一個miRNA均有成百上千個靶向蛋白，miRNAs的功能及靶向蛋白還與特定的病理生理情況有關[20]。因此，進一步探討miR-196a對宮頸癌細胞生存及運動過程相關靶向蛋白的影響，有利于了解宮頸癌的發病機制。

生殖細胞核受體NR6A1是一類轉錄抑制因子，在小鼠胚胎發育、神經再生和配子形成過程中發揮著重要作用[21]，并且在前列腺癌及膀胱癌中均呈高表達狀態[22]。本研究發現，NR6A1在宮頸癌Hela細胞中表達水平明顯升高，其可能參與了宮頸上皮細胞的異常分化，與宮頸癌的發生發展有關。進一步研究發現，NR6A1高表達能促進宮頸癌Hela細胞增殖、侵襲和遷移，并抑制癌細胞凋亡。本研究發現，抑制miR-196a表達能下調Hela細胞中NR6A1的表達水平，上調miR-196a表達能顯著誘導NR6A1表達，提示miR-196a可能靶向調控NR6A1表達。通過生物信息預測發現，NR6A1基因序列上有連續的miR-196a結合位點，熒光素酶報告實驗也進一步證明miR-196a可靶向調控NR6A1的表達。本研究表明，上調NR6A1表達能顯著減弱miR-196a inhibitor對宮頸癌Hela細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的調控作用，并顯著減弱miR-196a inhibitor對Ki-67、VEGF和MMP-9表達的抑制作用。Ki-67抗原是一種與細胞增殖相關的核蛋白，在腫瘤細胞增殖活性的檢測中，Ki-67是最可靠的指標之一[23]。VEGF是一種高度特異性的促血管生成因子，在多種惡性腫瘤中高表達，可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[24]。MMP-9作為MMPs家族的成員，是一種重要的細胞外基質蛋白水解酶，能夠水解基膜，從而促進腫瘤遷移[25]。因此，miR-196a對宮頸癌Hela細胞生存和運動能力的影響與靶向調控NR6A1表達有關。

綜上所述，下調miR-196a表達能降低宮頸癌細胞增殖倍數、侵襲細胞數和細胞劃痕閉合率，并顯著提高癌細胞凋亡率；同時，進一步上調NR6A1表達能顯著減弱miR-196a對宮頸癌Hela細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的調控作用。提示miR-196a能通過促進NR6A1表達在宮頸癌中發揮致癌作用，下調miR-196a表達能夠抑制NR6A1表達，從而延緩宮頸癌的發展。本研究首次探討了miR-196a與NR6A1的靶向關系及miR-196a通過靶向NR6A1在宮頸癌中的作用，為宮頸癌發生發展機制的探究提供了新的方向。