高效液相色譜-串聯質譜法測定化妝品中9種禁用生物堿

呂小會，羅輝泰，黃曉蘭，張秋炎，朱志鑫，吳惠勤

(1.廣東工業大學，廣東 廣州 510006；2.廣東省科學院，廣東省測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)，廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東 廣州 510070)

隨著經濟的日益發展和生活水平的不斷提高，化妝品市場展現出蓬勃生機，尤其對女性來說，化妝品已經成為一種不可缺少的日常用品[1]。在需求增加的同時，人們對化妝品質量提出了自然、健康的要求。近年來，將作用溫和、刺激性小、安全性高的植物提取物作為添加劑應用于化妝品中已成為新產品研發的熱點[2-4]。在化妝品中添加植物提取物既可以保留植物天然藥效成分的持久穩定、安全可靠，又具有美容、營養、保健的作用[5]。從化妝品中使用的天然植物劑型來看，一般采用萃取液或濃縮物直接進行調配，這些植物提取物中除了有益于人體的天然成分外，還可能會引入其他物質，例如有毒生物堿。這是一類主要存在于植物中的含氮堿性有機化合物，是植物次生代謝產物中的一類，具有顯著的藥理活性和毒性[6]，長期使用含有毒生物堿類物質的化妝品會給消費者的身心健康帶來極大傷害[5,7-8]。歐盟化妝品法規[9]和我國《化妝品安全技術規范》[10]明確將部分有毒生物堿列為禁用組分?！吨袊咽褂没瘖y品名稱原料目錄(2015版)》中顯示，允許在化妝品中使用的8 000多種成分中有2 000多種屬于天然植物提取物，而國內針對化妝品中禁用生物堿的相關檢測方法及標準卻明顯滯后，很多在《化妝品安全技術規范》中規定的禁用生物堿還缺少相應的檢測方法，在最新發布的國家標準方法[11]中也沒有全部涵蓋。

有關生物堿檢測的報道主要集中在血液、尿液、天然植物、食物等基質中[12-18]，檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[19]、高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)法[9,13-14,16,20]、氣相色譜-質譜(GC-MS)法[15,21]。其中，HPLC對復雜樣品具有高分離能力，但檢出限通常在100 μg/kg以上，不適合痕量檢測，同時僅以保留時間進行定性分析存在不足，當目標物濃度較低時，基質干擾嚴重、選擇性差、易出現假陽性結果[22]；GC-MS適用于揮發性和半揮發性成分的分析，而大部分生物堿屬于難揮發化合物；HPLC-MS/MS既具有HPLC的高分離能力，又具有質譜的高選擇性、高靈敏度以及能提供相對分子質量和結構信息的優點。因此，文獻報道主要采用HPLC法[19,23-24]和HPLC-MS/MS法[8,20,25]檢測化妝品中生物堿，但所涉及的生物堿種類較少。

本文擬針對《化妝品安全技術規范》中明確規定的禁用有毒生物堿種類，采用HPLC-MS/MS法同時測定化妝品中9種生物堿(士的寧、毛果云香堿、西伐丁、那可丁、山梗菜堿、阿托品、東莨菪堿、麻黃堿、毒扁豆堿)，并在樣品前處理過程中，將除脂與凈化同步進行，希望為化妝品中禁用生物堿的檢測及監控提供科學依據和技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1200 SL Series HPLC-6410B Triple Quard MS液相色譜-串聯四極桿質譜儀：美國 Agilent公司產品；KQ3200型臺式機械超聲波清洗器：東莞市科技超聲波設備有限公司產品；H1850離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司產品；XW-80A快速混勻器：海門市麒麟醫用儀器廠產品。

甲醇、乙腈：色譜純，德國Merck公司產品；甲酸：LC-MS級，美國Sigma公司產品；正己烷：分析純，廣州化學試劑廠產品；實驗用水為二次蒸餾水。

士的寧、毛果云香堿、阿托品、西伐丁、那可?。嘿徲谥袊幤飞镏破窓z定所；山梗菜堿、毒扁豆堿：美國Sigma公司產品；東莨菪堿、麻黃堿：天津一方科技有限公司產品。各生物堿純度均大于98%。

實際樣品：客戶送檢的植物草本化妝品，取樣前混合均勻。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取9種生物堿標準品，用甲醇溶解，配制成100 mg/L的單標準儲備液，置于棕色瓶中，于-20 ℃保存。根據需要吸取適量的標準儲備液，用陰性空白基質提取液稀釋定容，得到0.2、0.5、1、2、10、25、50和100 μg/L的系列標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1水基質類化妝品 稱取1 g(精確至0.001 g) 樣品于25 mL具塞比色管中，加入2 mL水，用氨水-甲醇溶液(2∶98，V/V)定容至10 mL，渦旋振蕩30 s，使樣品混合均勻，超聲提取10 min，過0.22 μm有機系濾膜后，待測。

1.3.2乳液膏霜基質類化妝品 稱取1 g(精確至0.001 g)樣品于25 mL具塞比色管中，加入1 mL水渦旋，使樣品分散，再加入1 mL正己烷，用氨水-甲醇溶液(2∶98，V/V)定容至10 mL，渦旋振蕩30 s，使樣品混合均勻，超聲提取10 min混合均勻試樣，轉移到25 mL離心管中，將離心管置于4 ℃冰箱中1 h，取出后以4 000 r/min離心10 min，棄去上層正己烷，取下層清液過 0.22 μm 有機系濾膜后，待測。

1.4 實驗條件

1.4.1色譜條件 色譜柱：Poroshell 120 Bonus-RP(3.0 mm×100 mm×3 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：A為0.2%甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.4 mL/min；進樣量：2 μL；梯度洗脫程序：0～1.5 min(98%A)，1.5～2.0 min(98%～90%A)，2.0～5.0 min(90%～85%A)，5.0～8.0 min(85%～75%A)，8.0～10.0 min(75%～40%A)，10.0～12.0 min(40%～20%A)，12.0～12.1 min(20%～5%A)，12.1～13.0 min(5%A)，13.0～13.1 min(5%～98%A)。

1.4.2質譜條件 電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描方式；多反應監測(MRM)模式；霧化氣壓力：2.76×105Pa；干燥氣流速：6 L/min；干燥氣溫度：300 ℃；毛細管電壓：4 000 V。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優化

化妝品成分復雜，化學原料種類多(如甘油、十八烷酸和陽離子表面活性劑等)，這些原料會對色譜分離和檢測過程產生干擾。因此，化妝品的提取和純化是實驗的關鍵。不同類型的化妝品因基質不同應選用不同的前處理方法，本文主要討論基質較復雜的乳液膏霜類化妝品。

2.1.1提取方法的優化 選擇甲醇、乙醇、乙腈3種常用的生物堿提取溶劑提取樣品，結果表明，采用甲醇和乙腈提取的樣品回收率較高。生物堿呈堿性，在堿性環境中容易游離出來，易溶于有機溶劑。因此，在甲醇和乙腈中分別添加不同含量的氨水，考察提取效果。結果表明，2%氨水-甲醇溶液作為提取溶劑的提取回收率最優。

常用的除脂溶劑為石油醚和正己烷，通過實驗發現，正己烷的除脂效果較好，示于圖1。理論上，應該在樣品提取后進行除脂，實驗中發現，在提取過程中同時加入1 mL正己烷也可以達到很好的除脂效果，并且不會對回收率產生影響，將提取與凈化同時進行，簡化了操作流程。乳液膏霜類化妝品一般包含脂溶型和水溶型。實驗發現，對于一些水溶型樣品，僅使用2%氨水-甲醇溶液作為提取劑，渦旋時有絮狀物出現，提取效果不好。為了兼顧不同類型，在提取過程中加入1 mL水分散樣品，使水溶型樣品可以得到充分提取。

注：A.士的寧；B.毛果云香堿；C.西伐??；D.那可??；E.山梗菜堿；F.阿托品；G.東莨菪堿；H.麻黃堿；I.毒扁豆堿圖1 9種生物堿在石油醚和正己烷中的回收率Fig.1 Recoveries of 9 alkaloids in petroleum ether and hexane

2.1.2超聲水浴時間的影響 乳液膏霜類化妝品的黏度較大，本實驗將渦旋振蕩與超聲水浴結合提取化妝品中生物堿。首先通過渦旋振蕩使樣品充分分散，再利用超聲水浴提取的空化效應使樣品分散均勻，使之與提取溶劑接觸更充分。本實驗考察了5、10、15、20、25 min超聲時間對化妝品中9種生物堿提取效率的影響。結果表明，生物堿的回收率隨超聲時間的延長而增大，10 min之后的回收率增長不明顯，為節約時間，選擇超聲時間10 min。另外，在提取過程中將樣品溶液置于4 ℃冰箱中冷藏1 h，可以減少油脂的抽提量[26]，有利于后續的實驗操作。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1色譜柱的選擇 Poroshell 120系列色譜柱由單步多孔殼層工藝制造而成，分離效率高，可以減少色譜柱批次之間的細微差異。本實驗考察了Poroshell 120的三款色譜柱SB-C18(2.1 mm×100 mm×2.7 μm)、Bonus-RP(3.0 mm×100 mm×3 μm)和HPH-C18(2.1 mm×100 mm×2.7 μm)的分離效果。結果表明，使用SB-C18色譜柱，西伐丁/山梗菜堿、士的寧/阿托品沒有達到基線分離；使用HPH-C18色譜柱，9種生物堿基本上實現了基線分離，但是峰形較差；使用Bonus-RP色譜柱，峰形較好，對阿托品和毒扁豆堿沒有選擇性分離，但由于這2種生物堿的分子質量差異較大，可以通過質譜區分，示于圖2。因此，選擇Bonus-RP色譜柱。此外，在Bonus-RP和HPH-C18色譜柱中，山梗菜堿都出現了2個色譜峰，二者的一級質譜和二級質譜基本一致，初步判斷是一對同分異構體，山梗菜堿結構中的酮基氮雜環己烷構型不穩定，在親水性溶劑或有羥基存在時，通過逆邁克爾加成生成同分異構體，即順式山梗菜堿會轉化為反式山梗菜堿，并最終達成平衡[27]。

注：1.毛果云香堿;2.麻黃堿;3.東莨菪堿;4.毒扁豆堿;5.阿托品;6.士的寧;7.那可丁;8.山梗菜堿;9.西伐丁圖2 9種生物堿的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of 9 alkaloids

2.2.2流動相的選擇 由于選擇電噴霧正離子模式(ESI+)采集質譜數據，故在流動相中加入酸性介質，有利于被測組分離子化，提高質譜響應和檢測靈敏度。在Bonus-RP色譜柱下，考察了0.2%甲酸水溶液-乙腈(或甲醇)，0.2%乙酸水溶液-乙腈(或甲醇)，以及0.2%甲酸水溶液(含10 mmol/L甲酸銨)-乙腈5種常用的流動相體系對目標物分離效果的影響。結果發現，在甲醇存在的體系下，9種生物堿不能得到很好的分離，而在0.2%甲酸水溶液(含10 mmol的甲酸銨)和0.2%乙酸水溶液-乙腈體系中，目標物的響應明顯降低。因此，選擇0.2%甲酸水溶液-乙腈體系作為流動相。9種生物堿的定量離子色譜圖示于圖3。

2.2.3流速的選擇 本實驗考察了不同流速對目標物的分離效果。結果發現，當流速較小時，峰形不好；當流速較大時，對毛果云香堿的保留變弱，出峰時間變早。綜上所述，選擇0.4 mL/min的流速。

注：a.士的寧；b.毛果云香堿；c.西伐??；d.那可??；e.山梗菜堿；f.阿托品；g.東莨菪堿；h.麻黃堿；i.毒扁豆堿圖3 9種生物堿的定量離子對MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of quantitative ion pair of 9 alkaloids

2.2.4柱溫的選擇 本實驗考察了20、25、30、35 ℃等柱溫條件對化合物色譜分離的影響。結果表明，當柱溫為30 ℃時，9種生物堿的響應最佳，保留值和色譜峰形最理想。

2.3 質譜條件的優化

在電噴霧離子源正、負離子模式下，對1 mg/L各待測物單標準溶液進行一級全掃描分析，獲得準分子離子。9種生物堿在正離子模式下的響應最高，主要原因是生物堿屬于含氮原子的雜環化合物，氮原子上存在的孤電子對容易加合氫離子，因此得到待測物的基峰離子均為[M+H]+。在正離子模式下對碎裂電壓和碰撞能量進行優化，為了滿足歐盟 EC/657/2002關于4個確證點的要求，以響應值最大的碎片離子為定量離子，次級響應的碎片離子為定性離子，優化后的質譜參數列于表1。

2.4 生物堿的質譜碎裂機理

生物堿的碎裂有以下特點：共軛環上的N不易發生碎裂，非共軛或不在環上的N則容易發生碎裂，如士的寧；部分莨菪烷類生物堿阿托品、東莨菪堿，由于在四氫吡咯環上沒有含氧基團，因此較穩定，而酯基的組分則易發生氫轉移，酯鍵斷裂；四氫吡咯吲哚生物堿主要先失去部分側鏈，其次是四氫吡咯環的裂解，如毒扁豆堿；當結構中含有內酯時，則易開環產生中性碎片CO2或HCOOH丟失，如毛果云香堿；含羥基組分易以H2O的形式產生中性碎片丟失，產生雙鍵形成共軛結構，在結構上達到局部穩定，如麻黃堿、西伐丁和山梗菜堿中H2O的丟失；那可丁的特征碎片以失去甲基或甲氧基為主要裂解方式。9種生物堿的裂解途徑示于圖4。

表1 9種生物堿的質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters of 9 alkaloids

2.5 方法評價

2.5.1基質效應 化妝品基質較復雜，可能干擾目標物的離子化效果，從而影響質譜響應。一般直接采用HPLC-MS/MS法進行分析時會有較強的基質效應[6,28]。本研究考察了3種乳液膏霜的基質效應，取陰性化妝品樣品，按1.3.2節方法處理后，加入一定量的標準儲備液，配制成1 μg/kg的基質標準溶液進樣分析，同時將1 μg/kg的標準溶液直接進樣分析。

(1)

式中，Mi為基質溶液中生物堿的基質效應；Ami為空白基質溶液中待測物的色譜峰面積；Asi為純溶劑中相應待測物的色譜峰面積。|Mi|<20%為弱基質效應；20%≤|Mi|≤50%為中等程度基質效應；|Mi|>50%為強基質效應。當基質效應在中等程度以上，影響定量結果時就需要對基質效應進行校正[29]。本實驗通過式(1)計算出3種不同乳液膏霜Mi的大致范圍在22%～43%之間，為中等程度基質抑制效應，示于圖5。采用空白乳液膏霜基質提取液配制標準工作液，稱取適量空白樣品，按1.3.2節方法進行前處理，制備空白基質溶液。用空白基質溶液將標準儲備液逐級稀釋得到系列標準工作溶液，使標準工作溶液和樣品溶液具有相似的離子化環境，確保方法定性與定量分析的準確性。

注：a.士的寧；b.毛果云香堿；c.西伐??；d.那可??；e.山梗菜堿；f.阿托品；g.東莨菪堿；h.麻黃堿；i.毒扁豆堿圖4 9種生物堿的裂解機理Fig.4 Fragmentation mechanisms of 9 alkaloids

2.5.2線性關系、檢出限和定量限 在最優的實驗條件下，分別測定9種生物堿質量濃度為0.20～600 μg/L的系列混合標準工作液。以混合標準工作液的質量濃度為橫坐標(x，μg/L)，以各生物堿的定量離子對色譜峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線，獲得線性回歸方程，相關系數為0.993 4～0. 999 8，表明待測物在各自的線性范圍內呈良好的線性關系。以信噪比S/N≥3和S/N≥10確定檢出限(LODs)和定量限(LOQs)，分別為0.03～0.36 μg/kg和0.1～1.2 μg/kg，結果列于表2。

2.5.3回收率和精密度 在最優的實驗條件下，選取4種基質較復雜的乳液膏霜類陰性樣品進行加標回收實驗。每種基質分別添加0.20、2.0 和 25 μg/kg 3個濃度水平的分析物混合標準工作液，按1.3.2節方法進行處理，每個濃度平行測定6次，計算平均回收率和相對標準偏差(RSD)，列于表3。結果表明，3種加標濃度的平均回收率為85.3%～135.3%，RSD為1.0%～13.4%，能夠滿足日?；瘖y品中9種生物堿的檢測要求。

2.6 實際樣品檢測

應用本方法檢測抽取的2份水劑和8份乳液膏霜類草本型化妝品中的生物堿，均未檢出，加標回收率在75.6%～117%之間，符合質控要求。

注：1.士的寧;2.毛果云香堿;3.西伐丁;4.那可丁;5.山梗菜堿;6.阿托品;7.東莨菪堿;8.麻黃堿;9.毒扁豆堿圖5 3種乳液膏霜基質中9種生物堿的基質效應Fig.5 Matrix effect of nine alkaloids in three cream bases

表2 9種生物堿的線性方程、相關系數、定量限、檢出限、線性范圍Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r2), limits of detection (LODs), limits of quantitation (LOQs) and linear ranges of 9 alkaloids

表3 9種生物堿的加標回收率及相對標準偏差Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of 9 alkaloids

續表3

3 結論

本研究建立了HPLC-MS/MS法同時測定化妝品中9種禁用生物堿，樣品前處理過程中將除脂與凈化同步進行，簡化了操作流程，同時探討了生物堿的質譜碎裂機理。該方法前處理簡便、高效，靈敏度可達0.03～0.36 μg/kg，回收率和精密度均能滿足化妝品中生物堿的檢測要求，可用于化妝品中禁用生物堿的監測。