澳洲堅果開花相關MiMADS-box基因克隆及表達載體構建

譚秋錦 張 濤 韋媛榮 鄭樹芳 湯秀華 王文林

（廣西南亞熱帶農業科學研究所，龍州 532400）

澳洲堅果（Macadamia integrifolia）起源于澳大利亞是一種果仁含有豐富的營養物質的果樹，果仁既可以生吃，也可以烘烤，或者作為各種加工食品的成分，特別是糖果產品［1］。澳洲堅果的果殼、油粕經加工成產品后可提高其經濟附加值［2］。我國澳洲堅果主要種植在廣西、云南等地域，由于其豐富的營養及特殊的口感深受消費者喜愛。我國澳洲堅果品種主要是引進國外高品質品種。在我國栽培馴化和品種選育期間，國外澳洲堅果品種需要調動體內復合調控機制的相關基因應對濕度和溫度等環境變化。由于目前國際、國內市場上澳洲堅果處于供不應求的情況，研究其產量相關基因的結構與功能為闡明開花機制打下基礎進而為澳洲堅果育種工作者提供理論指導。

MADS-box基因家族是一個家族成員均存在MADS-box 結構域的轉錄因子家族。在真菌、動物和植物中發現的MADS 家族在N 端有一個高度保守的DNA 結合域，名為MADS。MADS-box基因已經在許多不同的植物物種中被發現。在植物中，MADS-box主要分為I型（SRF-like MADS-box）和Ⅱ型（MEF2-like MADS-box），其中Ⅱ型具有典型的MADS、I、K、C 結構域，也被稱為MIKC 型基因［3］。MADS 區域包含一個高度保守的區域，大約有60個氨基酸，MADS區域專門與DNA結合［4］。Ⅰ區由30～35 個氨基酸組成，含有較多的親水性殘基，具有DNA 特異性結合的功能［5］。K 區由65～70 個氨基酸組成，介導蛋白質之間的相互作用。C區由約30 個疏水性氨基酸組成［6］。根據MADS-box基因編碼的K-domain 結構域的長度和系統進化分析，可將MIKC 型基因分為MIKCC和MIKC*兩類［7～8］。在開花植物中，研究表明MADS-box基因具有廣泛的功能，參與花的形成（包括生殖結構的發育），開花時間的調控和營養生長的調控。擬南芥開花時間受三個基因通路的控制。MADS-box基因FLOWERING LOCUS C（FLC）負調控從營養階段到生殖階段的過程；CONSTANS（CO）基因調控光周期途徑并在長日光的條件下促進開花；赤霉素途徑依賴于植物激素赤霉素通過激活分生組織特性基因LEAFY（LFY）傳遞信號［3］。TCP和MADS-Box轉錄因子調控非洲菊異型花型識別［9］。在核桃和擬南芥中，MADS-box基因AGAMOUS-LIKE12 的過表達激活了根的發育［10］。BcAP3是一個MADSbox基因，它控制著小白菜的雄蕊發育和雄性不育［11］。OsMADS18 是一種膜結合MADS-box 轉錄因子，它調節水稻株型和脫落酸的響應［12］。MADS-box基因家族成員在擬南芥、水稻等模式植物中研究較為深入，然而澳洲堅果相關研究甚少。本研究從“桂熱1號”品種的葉片中克隆MADS-box基因，利用生物信息學對其結構和功能進行分析并構建亞細胞定位載體pGREEN-MiMADS-box。研究MADS-box基因家族成員的結構與功能為闡明澳洲堅果開花機制打下基礎，對促進產業發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料“桂熱1號”和“695”品種由廣西南亞熱帶農業科學研究所澳洲堅果種質圃（E106.79.84，N22.14.34）提供。農桿菌GV3101 菌株、大腸桿菌（E.coil）DH5-α感受態、反轉錄試劑盒購自Takara公司，Phanta高保真酶、ClonEXpress Ⅱ試劑盒、第二代TOPO克隆試劑盒均購自南京諾唯贊公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取總RNA和cDNA的合成

澳洲堅果RNA 的提取、反轉錄及濃度測定參考王文林的方法［13］。將提取的RNA及反轉錄獲得的cDNA，配制1%瓊脂糖凝膠并進行電泳檢測。

1.2.2 克隆MADS-box基因全長

根據澳洲堅果轉錄組序列，利用primer primer6.0 軟件設計引物MiMADS-box F，5′-TTCGTTCGTTTCAGGTTTCAG-3′，MiMADS-box R，5′-TCTCATCAGAGCCGCTTCC-3′，引物序列由公司合成。以澳洲堅果“桂熱1 號”品種正常葉片的cDNA 為模板，按照高保真酶試劑盒說明書，利用PCR 擴增Mi MiMADS-box的全長序列，將目的條帶按照膠回收試劑盒進行回收純化，目的片段連接PCE2 TA/Blunt-Zero 載體，室溫反應5 分鐘，轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，經PCR 檢測后挑取陽性克隆測序。

1.2.3 MADS-box亞細胞定位載體構建

通過CD designV1.04 軟件設計帶酶切位點插入片段的同源重組引物MiMADS-box-ORFHindⅢ-F，5′-gtcgacggtatcgataagcttATGGGAAGAGGTCCGGTTCA-3′，MiMADS-box-ORRBamH Ⅰ-R，5′-tttactcatactagtggatccTTCCCGTGACAGCATCCAA-3′。以PCE2 TA/Blunt-Zero-MiMADS-box 的質粒為模板利用PCR克隆目標插入片段。利用內切酶HindⅢ、BamHⅠ對綠色熒光融合表達載體pGREEN 改造載體進行雙酶切并膠回收，按照ClonEXpress Ⅱ試劑盒說明書進行連接，利用含卡那霉素的培養基篩選并測序檢測。

1.2.4 MiMADS-box生物信息學分析

參照樊松樂的方法對MiMADS-box-ORF 進行生物信息學預測分析［14］。利用DNAMAN 工具軟件進行多序列比對。MEGAX 構建系統進化樹（neighbor-joining，bootstrap 值設為1000）。用于系統進化分析的蛋白序列從PlantTFDB、NCBI下載。

2 結果與分析

2.1 MiMADS-box基因克隆

以澳洲堅果“桂熱1 號”品種葉片的cDNA 為模板，采用PCR 擴增MiMADS-box，結果如圖1A 所示，擴增出了與預期大小相符的特異性條帶。測序驗證后，將cDNA 序列命名為MiMADS-box。Mi‐MADS-box基因的cDNA 全長序列1 180 bp，包含729的開放閱讀框（ORF），編碼242個氨基酸。

2.2 MiMADS-box蛋白質的理化性質預測

ProtParam 工具在線分析MiMADS-box 氨基酸編碼蛋白質的理化性質：分子式C1212H1971N363O378S10，總原子數3 934，分子量為27 996.79 Da，等電點9.22，總平均親水性為-0.917，帶正電殘基總數（Arg+Lys）為38，帶負電荷殘基總數（Asp+Glu）為31，不穩定系數為57.39（該蛋白屬于不穩定蛋白），脂肪族氨基酸指數是76.94，推測MiMADSbox蛋白是一個不穩定的親水蛋白。

2.3 MiMADS-box蛋白質的磷酸化位點、跨膜結構及亞細胞定位預測

NetPhos 3.1 在線分析工具預測MiMADS-box蛋白磷酸化位點，結果表明，MiMADS-box 氨基酸序列可能發生磷酸化的位點共有21 個，絲氨酸磷酸化位點14，蘇氨酸磷酸化位點6 個，酪氨酸磷酸位點1 個。利用TMPred 在線工具分析預測表明MiMADS-box 蛋白無跨膜結構。SignalP-5.0 Server分析預測MiMADS-box 存在信號肽的概率為0.04%。PlantmPLoc2 預測分析MiMADS-box 蛋白定位于細胞核中。綜上MiMADS-box 編碼一個非分泌型且無跨膜結構的轉錄因子蛋白。

2.4 MiMADS-box 蛋白質保守結構域、二級結構、三級結構分析

NCBI 保守結構域工具分析預測表明Mi-MADS-box 蛋白存在MADS superfamily 和K-box superfamily 結構域，其位置分別位于2-79 和83-167，推測其屬于Ⅱ型（MEF2-like MADS-box）也稱為MIKC 型基因（見圖2A）。利用SOPMA 分析Mi-MADS-box 蛋白的二級結構，結果顯示α 螺旋占51.65%，延長鏈占10.33%，β折疊占4.55%，無規卷曲占33.47（見圖2B）。利用PHYRE分析MiMADSbox的三級結構如圖3C所示。

2.5 MiMADS-box系統進化分析

如圖4所示，澳洲堅果MiMADS-box與大豆Gm-CAULIFLOWER A（Glycine max，XP_003547792.1、擬 南 芥AtMADS-box（Arabidopsis thaliana，NP_177074.1）、荷花NnCAULIFLOWER A（Nelumbo nu‐cifera，XP_010260844.1）、黃 花 假 煙 堇PlFRUITFULL（Pseudofumaria lutea，AGX01535.1）和碎米蕨葉 黃 堇CcFRUITFULL（Corydalis cheilanthifolia，AGX01538.1）進行同源性分析，相似性分別為68.18%，61.24%，72.80%，75%和71.83%。多序列比對分析并根據圖3A 分析的結果標注MiMADSbox 保守結構域（見圖2A）。利用TBtools 中的MEME工具分析澳洲堅果MiMADS-box與其在NCBI 數據庫中比對親緣性較高的MIMADS-BOX 蛋白序列，預測了排名前三的motif（見圖3B）。系統進化分析澳洲堅果MiMADS-box 與76 個擬南芥MICK 型 家 族 成 員，MiMADS-box 與AT1G69120.1（AGL7/AP1） 、AT1G26310.1 （AGL10/CAL1） 、AT5G60910.1（AGL8/FUL）、AT3G30260.1（AGL79）親 緣 關 系 較 近，AT1G69120.1（AGL7/AP1）、AT1G26310.1 （AGL10/CAL1） 、 AT5G60910.1（AGL8/FUL）、AT3G30260.1（AHL79）屬于擬南芥MIKCC型的FUL-AP1 亞族成員（見圖4），推測Mi-MADS-box 與FUL-AP1 亞族成員具有相似的功能［15～16］。

2.6 MiMADS-box基因組織表達模式分析

“桂熱1號”和“695”品種澳洲堅果不同組織枝條、花、和葉片轉錄組數據表明MiMADS-box基因在“桂熱1號”品種的葉片中表達最高，花中的表達量較低，葉片中MiMADS-box基因表達量是花的21倍左右；“695”品種中，MiMADS-box主要在花中表達最高，花中的表達量是葉片的12.5 倍左右?！肮馃? 號”和“695”品種同一組織MiMADS-box基因的表達在花和葉片中相差較大，特別是其在花中的表達量“695”是“桂熱1 號”的30 倍左右（見圖5）。

2.7 MADS-box亞細胞定位載體構建

利用PCR 克隆目標插入片段MiMADS-box-ORF，擴增出了特異性目標條帶（見圖1B）。利用內切酶HindⅢ、BamHⅠ對綠色熒光融合表達載體pGREEN 改造載體進行線性化。利用同源重組的方法構建了pGREEN-MiMADS-box-ORF-GFP融合表達載體，并利用pGREEN 鑒定引物35S：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCGA-3′和MiMADS-box-ORRBamHⅠ-R，5′-tttactcatactagtggatccTTCCCGTGACAGCATCCAA-3′，并挑取陽性克隆送測序（見圖6）。選擇測序正確的陽性克隆進行電擊轉化農桿菌GV3101，保存菌種。

3 討論

澳洲堅果是澳大利亞東部亞熱帶雨林特有的一種堅果作物，在澳大利亞、南非、夏威夷、巴西、中國和其他國家都有種植。澳洲堅果是無性繁殖的，不同品種之間需要異花傳粉［17］。不同的澳洲堅果品種的雜交花粉會造成澳洲堅果的核質量、果仁質量、殼質量和核回收率的差異［18］。澳洲堅果的全球產量約為10 萬噸（果仁），其中86%來自五個最大的生產國，包括澳大利亞（32%）、南非（30%）、肯尼亞（12%）、美國（8%）和馬拉維（4%）［19］。在國內和國際市場上整體上處于供不應求的狀態。分子育種在植物遺傳改良中扮演著重要的角色，不但能縮短育種周期，還可產生較大的經濟、生態效益?；蚩寺?、載體構建、結構與功能分析是分子育種的基礎。

本研究從澳洲堅果“桂熱1 號”的葉片克隆了MiMADS-box基因，推導的氨基酸序列為729 bp ORF，編碼242 個氨基酸。生物信息學分析發現，MiMADS-box 存 在MADS superfamily 和K-box superfamily結構域，推測屬于澳洲堅果MIKCC型基因家族成員。MiMADS-box 定位于細胞核是一個無信號肽、無跨膜結構的不穩定親水蛋白。

澳洲堅果MiMADS-box 與大豆GmCAULIFLOWER A 擬南芥AtMADS-box、荷花NnCAULIFLOWER A、黃花假煙堇PlFRUITFULL 和碎米蕨葉黃堇CcFRUITFULL 同源性較高。系統進化分析證明MiMADS-box 與AGL7/AP1、AGL10/CAL1、AGL8/FUL、AGL79 親 緣 關 系 較 近，AGL7/AP1、AGL10/CAL1、AGL8/FUL、AGL79 屬 于 擬 南 芥MIKCC型的FUL-AP1（SQUA）亞族成員［20］。從圖5可知，“桂熱1 號”中，MiMADS-box在花中的表達量最低，“695”中花中的表達量最高。MADS-box基因控制植物的多種生物過程，包括營養生長和生殖發育，主要在花序、花和果實的發育過程中起關鍵作用。隨后，構建pGREEN-MiMADS-box-ORF-GFP 融合表達載體轉化農桿菌GV3101 以期利用亞細胞定位技術證明MiMADS-box 轉錄因子定位于細胞核及利用遺傳轉化技術轉化煙草進行基因功能驗證。在擬南芥中，MIKCc基因家族被分為13個分支。在水稻中也發現了FLC分支以外的所有分支的代表。在擬南芥中，有6個屬于FLC分支的基因參與了春化和自主途徑的開花控制［21］。矮牽牛AP1/SQUA 亞家族的4 個成員對于花序分生組織的特性是必需的［22］。Chen 等構建大豆AP1同源基因GmAP1 亞細胞載體，實驗表明定位于細胞核。利用遺傳轉化技術獲得突變體植株進行功能驗證，結果表明GmAP1 調控大豆花期和株高［23］。荷花NnAP1在控制花分生組織的特性和花器官的形成中起著重要的作用［24］。擬南芥AGL8基因在花序分生組織中表達，并受APETALA1 負調 控［25］。其 他 植 物AGL9/SEP 蛋 白 相 比，Gm-MADS28 調控花器官數量、花絲長度和花粉釋放［26］。SPL10 可 直 接 與AGL79啟 動 子 結 合，miR156/SPL10通過調控AGL79（定位于細胞核）在植物側根生長中發揮作用［27］。在轉基因擬南芥中，黃瓜（Cucumis sativusL.）的APETALA1-like基因過表達可誘導其提早開花和葉片發育異常［28］。BpAP1過表達轉基因白樺葉片和雄花序中這7 條基因（BpAP1、BpPI、BpMADS4、BpMADS5、FT、TFL1和LFY）的表達量在不同發育時期均顯著高于NT（野生型）和BpAP1抑制表達轉基因白樺［29］。李爽等人構建了prokⅡ-PsnAP1-1 過表達載體轉化農桿菌并侵染煙草，結果表明轉基因煙草比野生型提早開花［30］。王企等人對核桃FRUITFULL（Jr‐FUL）基因進行了克隆、生物信息學及熒光定量PCR 實驗，結果表明JrFUL 參與核桃開花中，可能對雄花的開放有促進作用［31］。綜上，推測Mi-MADS-box 參與調控澳洲堅果開花及花器官發育的過程，筆者成功的構建了該基因的植物表達載體，為深入研究其調控機制打下堅實基礎。