基于DNA條形碼的柳屬植物系統發育研究

任偉超 徐 姣 孫 偉 劉美琦 于欣欣 王思嘉 馬 偉*

（1. 黑龍江中醫藥大學藥學院，哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫藥大學佳木斯學院，佳木斯 154007；3. 中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700）

近年來，DNA 條形碼技術已被陸續應用于木本植物及相應木材的種質鑒定，在目標基因選擇、DNA 提取及生物信息學分析等方面均取得顯著進展［1］。植物DNA 條形碼的研究主要集中于葉綠體基因組和核基因組。葉綠體片段（matK、rbcL 和psbA-trnH）和核基因片段（ITS）已廣泛應用于高等植物DNA 條形碼研究中［2～10］。目前關于柳屬植物的DNA 條形碼技術分析的相關研究較少。劉明航［11］對垂柳、曲枝垂柳、龍爪柳的ITS 序列進行擴增及測序分析，結果表明曲枝垂柳、龍爪柳、垂柳、旱柳差異是種內變異水平，應為一個種。該結論與傳統柳屬的分類存在明顯的不同。王東超［12］對32 種柳屬進行測序，結果支持將鉆天柳歸入柳屬當中且與大白柳為一支。準葛爾柳與本組另外兩種親緣關系遠，可以單獨分支，建議四子柳和纖序柳合并為一個種，建議紫柳組分為兩個類群。

DNA 條形碼技術是以染色體組為基礎，用一段標準DNA 序列作為標記實現快速、準確和自動化的物種鑒定方法［13］，具有以下優點［14～15］：①由于具有穩定的遺傳信息，不受檢測樣本形態變化的影響。②對在形態學上相近的物種進行物種鑒定。③建立數據庫完善遺傳信息，彌補傳統分類對物種形態描述的不足。該技術已廣泛應用于動植物物種鑒定、中藥材混偽品鑒定、進出口檢驗檢疫、食品安全檢測等。林業方面利用DNA 條形碼技術對木材種類進行監管，同時還能規范木材貿易市場和保護珍貴瀕危樹種。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選取黑龍江省分布的柳屬植物，樣本采自于伊春、哈爾濱、大慶、塔河，共計11 個物種40份樣本。所有憑證標本保留在黑龍江中醫藥大學藥學院。具體采集地、海拔及經緯度信息見表1。本研究采用新鮮、成熟、健康的柳屬葉片作為提取DNA的實驗材料。將樣本置于其中40℃中烘干24 h。本研究引用的序列Genbank 登陸號與其對應的物種名見表2。

表2 研究引用GenBank中的序列Table 2 The GenBank sequences used in study

1.2 基因組DNA提取

取植物樣本約50 mg 加入液氮充分碾磨。向粉末中加入700 μL DNA裂解液，56℃水浴2 h。采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

1.3 PCR擴增與測序

ITS2 通 用 引 物S2F：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3' 和S3R：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。反應條件為94℃，5 min；（94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，45 s）40 個循環；72℃，10 min。psbA-trnH 引 物PA：5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3' 和 TH： 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'。反應條件為94℃，4 min；（94℃，50 s；58℃，50 s；72℃，50 s）40個循環；72℃，7 min。擴增體系均為25 μL，DNA 模板2 μL，正反向引物各1 μL，MIX 8.5 μL，ddH2O 12.5 μL，擴增產物置于4℃保存。在1.0%瓊脂凝膠中，每份DNA 樣本點樣5 μL，電源電壓設置為120 V，電泳時長30 min。將膠置于凝膠成像系統檢測，結果是ITS2 序列PCR 產物約在500 bp 處出現目的條帶，陰性對照無條帶。選取有條帶的PCR產物進行雙向測序。

1.4 數據分析

利用CodonCode Aligner V 3.7.1 軟件，將正反兩個方向測序峰圖進行校對拼接獲得完整序列。針對ITS2序列，需要去除引物區和低質量區，對序列進行注釋。去除5.8 S 和28 S 區段，獲得ITS2 間隔區序列；針對psbA-trnH 序列，校對拼接后去除引物區和低質量區。然后將所有序列用MEGA7.0軟件進行分析比對，以Kimura2-parameter（K2-P）為遺傳距離模型，計算并比較各序列種間、種內遺傳距離，用鄰接法構建系統聚類樹，利用bootstrap（1 000次重復）檢驗各個分支的支持率［16］。

2 結果與分析

2.1 上傳新型ITS2序列至NCBI數據庫

本研究中共向NCBI 數據庫中提交12 個物種共計40 條ITS2 序列，包括鉆天柳3 條；柳屬37 條，其中白皮柳（MT177150）、圓頭柳（MH924219，MT177162）、烏柳（MH924218）、筐柳（MT177181，MT177182）和 卷 邊 柳（MT177183，MT177184，MT177185，MT177186）共計10 條ITS2 序列為首次提交至NCBI 數據庫。具體40 條ITS2 序列信息見表3。

表3 上傳至GenBank的柳屬、鉆天柳ITS2序列注冊編號Table 3 The numbers of ITS2 sequences date of Salix，Chosenia arbutifolia uploaded to GenBank

2.2 柳屬與鉆天柳、山楊的種間遺傳距離分析

針對能夠準確鑒定的5個物種進行種間、種內遺傳距離分析?？鹆N內遺傳距離為0；與其它4種的種間遺傳距離最小為0.009 3，與其它4 種的種間遺傳距離最大為0.090 1。鉆天柳種內遺傳距離為0；與其它4種的種間遺傳距離最小為0.009 3，與其它4 種的種間遺傳距離最大為0.084 4。粉枝柳種內最大遺傳距離為0.004 6，其種內平均遺傳距離為0.001 0；與其它4 種的種間遺傳距離最小為0.009 3，與其它4 種的種間遺傳距離最大為0.089 8。五蕊柳種內遺傳距離為0；與其它4 種的種間遺傳距離最小為0.014 1，與其它4 種的種間遺傳距離最大為0.095 6。山楊種內遺傳距離為0，與其它4 個種的種間遺傳距離最小為0.084 4，最大為0.095 6。由于以上5 個物種種內最大遺傳距離數值小于與其他物種種間最小遺傳距離數值，故用ITS2 序列能夠對筐柳、鉆天柳、粉枝柳、五蕊柳、山楊進行準確鑒定（見表4）。

表4 柳屬、鉆天柳及山楊種內及種間遺傳距離Table 4 The interspecific genetic distance and genetic distance between Salix，C.arbutifolia and P.davidiana

2.3 基于ITS2 序列的柳屬、鉆天柳和山楊NJ 樹鑒別

基于各物種ITS2 序列構建Neighbor-Joining（NJ）樹（見圖1）：五蕊柳能聚為一支，支持率為67%；粉枝柳能聚為一支，支持率為63%；筐柳能聚為一支，支持率為66%；蒿柳能聚為一支，支持率為64%；以上4種柳屬可明顯的與其他物種互相區分開。而卷邊柳同屬蒿柳組，不能自聚為一支，僅能鑒定到蒿柳組級別，支持率為62%；旱柳、朝鮮柳、白皮柳、圓頭柳同屬柳組，同樣不能各自聚為一支，僅能鑒定到組級別，支持率為90%。另外鉆天柳能聚為一支，支持率在64%，與柳屬中五蕊柳、粉枝柳遺傳距離較近。因此基于ITS2 序列的DNA 條形碼鑒定方法能將五蕊柳、粉枝柳、筐柳、蒿柳與其他物種區分開，柳組物種僅可鑒定到組級別。

2.4 基于psbA-trnH 序列的柳屬系統發育樹鑒別

對從40 份DNA 樣本進行psbA-trnH 序列的擴增，有35 份樣本擴增成功，擴增成功率為87.5%。采用MEGA7.0 軟件NJ 法，對擴增成功的35 份樣本psbA-trnH 序列構建系統發育樹，得到系統聚類（見圖2），在以psbA-trnH 基因片段序列建立的系統發育樹中，不同物種不能各自獨立聚為一支。

3 討論

柳屬植物具有重要的經濟價值。廣泛應用于園林綠化、制作手工藝品、防風固沙等方面。在形態學上，由于柳屬植物雌雄異株、先花后葉、分布范圍廣、對環境適應性強、不同種之間受人為或自然雜交因素的影響，都使得柳屬植物在物種鑒定上存在難度。因此，柳屬植物的形態學鑒定及分子鑒定一直是廣大科研工作者專注研究的課題。

本研究以柳屬和鉆天柳、山楊為研究對象。探索葉綠體基因（psbA序列）和核基因（ITS2序列）在柳屬植物鑒定方面的應用。在擴增效率方面，ITS2 的擴增效率為100%，而psbA-trnH 的擴增效率為87.5%。在物種鑒定方面，ITS2序列可將五蕊柳、粉枝柳、筐柳、蒿柳與其他物種區分開，柳組物種可鑒定到組級別。同時，由于信息位點少，兩大群內部形成許多小的分支后驗概率偏低，內部的系統發生關系仍沒有得到解決。ITS2 序列系統發育樹顯示，鉆天柳（鉆天柳屬）與柳屬植物的親緣關系極為接近，本研究結果可作為把鉆天柳歸為柳屬的分子學依據。在由psbA-trnH 序列建立的系統發育樹中，柳屬各物種的聚類較為混亂。這是由于柳屬不同組的各物種，它們擁有相同的葉綠體單倍型，此現象可能與柳屬的特殊種群進化方式有關，例如雜交和選擇性捕獲［17］。該差異造成了核基因片段（ITS2）和葉綠體片段（psbA-trnH）對物種鑒定效果的差異。趙奉彬［18］利用核基因組片段在楊屬的區分上具有較好效果，而葉綠體片段并不能得到很好結果。本研究得到相似結論即核基因片段在柳屬的區分上比葉綠體片的分辨率好，而葉綠體片段的柳屬分辨率遠遠低于核基因組片段。psbA-trnH 序列對柳屬植物的分子鑒定效果不理想，與之相比較ITS2 序列在柳屬植物分類鑒定上具有一定的優勢。

對ITS2可準確鑒定的物種旱柳、朝鮮柳、圓頭柳、粉枝柳結合地理分布信息進行分析。研究發現，旱柳、朝鮮柳、圓頭柳均采自于伊春、哈爾濱、大慶，這三地地理緯度接近，而粉枝柳采自伊春和塔河且兩地的地理緯度相差近5 個緯度；在ITS2系統發育樹中也有所體現，采自伊春的粉枝柳樣本聚為一支，采自塔河的樣本獨立于伊春樣本聚為另一支。結果表明不同地理居群在種內進化存在地域性，但由于樣本數較少影響了鑒定的準確性，在后期研究中可擴大取樣范圍和取樣數量。

通過對收集到的各物種樣本形態學觀察，同時結合ITS2序列構建的系統發育樹。柳組各物種葉片的形態基本一致，這與ITS2 序列僅能鑒定到柳組級別的結果相一致。其它可運用ITS2準確鑒定的物種，其葉片性狀與其他物種均存在差異。這表明，對葉片的形態學鑒定和運用ITS2 序列鑒定結果基本一致。本研究證明基于ITS2 序列的DNA 條形碼技術對楊柳科的鑒定有效，建議楊柳科的分子學鑒定方法可采用以核基因組片段（ITS或ITS2）單獨或組合形式的DNA條形碼鑒定。