6種野生金花茶葉表皮微形態特征及其系統學意義

朱栗瓊 覃冬梅 招禮軍* 鄧斌勝 劉晟源 蔣昌杰

（1. 廣西大學林學院，廣西森林生態與保育重點實驗室，南寧 530004；2. 崇左市林業科學研究所/崇左市園林科學技術研究所，崇左 532200；3. 廣西弄崗國家級自然保護區管理局，龍州 532400；4. 南寧市金花茶公園，南寧 530022）

金花茶組（Sect.Chrysantha）為山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）常綠灌木或小喬木植物，主要分布于我國廣西、云南及越南交界處較窄范圍，常生長在陰涼、潮濕、陽光不能直射的山林中，伴生于熱帶性樹種林下［1］，是我國珍稀瀕危植物。金花茶組植物因花色金黃，具有“茶族皇后”的美譽，是培育黃色系山茶花的優良遺傳基因資源，同時其體內含有黃酮、茶多酚、多種氨基酸、維生素以及微量元素等，具有較高的營養和藥用價值。因此，引發了研究者的興趣，在金花茶資源調查［2～3］、形態［4］、分類［5～7］、遺傳［8～9］、繁育［10～11］、化學成分［12］等方面均有研究報道。在形態解剖學方面，主要從葉片橫切面及表皮特征出發，尋找金花茶種間差異，以此作為分類依據，如鄒琦麗［13］對9 種金花茶葉解剖發現葉表皮細胞有多角形和不規則形兩種類型；王任翔等［14～15］用掃描電鏡觀察了20種金花茶葉表皮微形態特征，在氣孔外拱蓋表面和內緣、角質膜等發現了具有分類意義的性狀；李鳳英等［16］在金花茶25個分類群葉下表皮中發現角質膜、細胞垂周壁式樣及氣孔形狀等特征有一定分類學意義。植物葉表皮的微形態特征被認為在同一地理分布區域內表現出較強的一致性，可作為屬種間的分類依據［17～18］。葉的形態結構受環境影響較明顯，因此用原產地的野生種來研究葉表皮的微形態特征保守性和可靠性更強。本研究以金花茶原生地廣西弄崗國家級自然保護區的6 種野生金花茶的成熟葉片為對象，從葉表皮微形態的觀察和數量特征統計出發，比較6種野生金花茶種類之間的差異性，并探索各種間的親緣關系，為金花茶的分類學基礎研究提供理論依據，同時探討了該6種金花茶葉片微形態特征對當地特殊環境的響應策略，為制定野生金花茶的保育措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣地基本情況

實驗材料采自廣西西南部崇左市的弄崗國家級自然保護區，地理位置106°42′28″～107°4′54″E，22°13′56″～22°39′9″N，屬于裸露型喀斯特區域，主要由“峰叢—洼地”鑲嵌而成，石山峰海拔400～500 m，隸屬于北熱帶季風氣候，年均溫22℃，極端最高溫40.5℃，極端最低溫-3℃，≥10℃的年積溫7 834℃，年均降雨量1 150～1 550 mm，干濕季明顯，其中5～9月為雨季，土壤以棕色和黑色石灰土為主。

本研究以保護區自然生長的6 種野生金花茶為材料，分別是凹脈金花茶（Camellia impressinerv‐is，IM）、薄葉脈金花茶（C. chrysanthoides，CH）、毛籽金花茶（C.ptilosperma，PT）、檸檬黃金花茶（C.li‐menia，LI）、弄崗金花茶（C. longgangensis，LO）、四季金花茶（C.perpetua，PE）。每個種類各選擇5 株長勢中等的樣樹，在東南西北四個方向選取中部枝條，分別剪取頂芽下5～7節的成熟健康葉片，用FAA液固定。

1.2 制片方法

表皮離析片的制作：剪取葉片近中部葉脈兩側部分約0.5 cm×0.5 cm 小塊樣品，將其浸泡于等量的30%過氧化氫溶液和醋酸溶液中，置于60℃水浴鍋中3 h，蒸餾水漂洗后再用次氯酸鈉溶液離析至透明，再次漂洗干凈，撕取表皮，裝片，于NikonE200光學顯微鏡下觀察、拍片及測量。測量和計算指標有：氣孔長度、氣孔、氣孔、指數［氣孔數/（氣孔數+表皮細胞數）］和上、下表皮細胞密度。

掃描電鏡制片：剪取固定好的葉片近中部葉脈兩側約0.5 cm×0.5 cm 的小方塊，蒸餾水漂洗后，每隔15 min 用磷酸緩沖液沖洗1 次，重復3 次。再每隔10 min 進行1 次乙醇脫水，乙醇梯度變化為：50%—70%—80%—90%—100%，脫水自然干燥后取出，粘臺，噴金，于Phenom Pro 800-07334 掃描電子顯微鏡下觀察和拍照。

1.3 數據分析

數據分析以及制圖均用SPSS 20.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 葉表皮顯微形態特征

光學顯微鏡下，發現6種金花茶的葉片氣孔均分布在遠軸面（下表皮），近軸面上未見氣孔的出現，上、下表皮細胞均為不規則狀，垂周壁都出現淺波至深波不等的起伏，每種上表皮細胞形狀及大小較均勻，下表皮細胞組成大小不一；所有種類的氣孔器均由3 個大小不等的副衛細胞及2 個腎形的保衛細胞而成，屬環列型氣孔，氣孔器呈寬橢圓形，而張開的氣孔為橢圓形，但氣孔長軸與短軸比例種間有所不同，另外在種間上還存在保衛細胞兩級的T 型加厚具明顯和不明顯兩種類型（見圖1）。6 種金花茶葉的表皮細胞及氣孔器的形態特征見表1。

表1 6種金花茶葉表皮細胞及氣孔器顯微形態特征Table 1 The features of leaf epidermal cells and stomatal apparatus of six golden camellia species

2.2 葉片表皮超微形態特征

掃描電鏡下觀察發現，6 種金花茶上、下表皮細胞形狀不規則，大小不等，凹凸也不一致，氣孔隨機分布，除四季金花茶的上、下表皮細胞的輪廓不清楚外，其余五種表皮細胞輪廓均清晰可見（見圖2～3）。表皮細胞平周壁除四季金花茶的上表皮與細胞持平，檸檬黃金花茶下表皮向上突起外，其余的均呈下陷狀；下表皮角質層紋飾分為兩類，一種是輻射狀，包括毛籽金花茶和弄崗金花茶，其余的皆為線狀。所有種類表皮細胞外蠟質層均有不同程度的絲狀飾紋，有的還分布有鏈狀、絮狀或顆粒狀飾紋，比較特殊的是四季金花茶上表皮蠟質層還有乳突、下表皮蠟質層還有痂狀飾紋。6 種金花茶葉表皮超微形態特征見表2。

表2 6種金花茶葉表皮細胞輪廓和飾紋超微形態特征Table 2 The ultra-structure of leaf epidermal cells and ornamentation of six golden camellia species

掃描電鏡下觀察氣孔器及其外拱蓋特征見表3。從圖2～3 中可看出，金花茶氣孔器呈近圓形或橢圓形，氣孔器鑲嵌于下表皮細胞位置有兩種狀態，其中凹脈金花茶、薄葉金花茶、毛籽金花茶和弄崗金花茶氣孔器與表皮細胞位置相持平，而檸檬金花茶和四季金花茶氣孔器則呈下陷狀。6 種金花茶氣孔器外圍角質層均有飾紋，但飾紋類型不同，凹脈金花茶為單層不完全環形，薄葉金花茶為多層不明顯環形，毛籽金花茶、檸檬黃金花茶、弄崗金花茶呈環形，四季金花茶的飾紋有兩層，外層左右各一條呈括弧狀，與氣孔長軸方向一致，內層呈環形；氣孔外拱蓋表面除四季金花茶的為粗糙型外，其余的皆為近平滑型，而氣孔外拱蓋內緣形狀，除凹脈金花茶為較平直外，其余的皆為淺波狀。

表3 6種金花茶氣孔器及氣孔外拱蓋超微形態特征Table 3 The ultra-structure of stomatal apparatus and outer stomata ledge of six golden camellia species

2.3 6種金花茶葉表皮特征數值比較

葉片表皮包括表皮細胞和氣孔兩部分，本研究所測6 種金花茶葉表皮細胞及氣孔的相關數量特征及統計結果見表4。

表4 6種金花茶葉表皮細胞及氣孔數量特征Table 4 The quantitative features of leaf epidermal cells and stomata of six golden camellia species

氣孔長度變化范圍是12.28±0.34～15.57±0.16 μm，除四季金花茶顯著小于（P＜0.05，下同）其它五種外，其它五種間差異不顯著（P＞0.05，下同）；氣孔寬度在8.14±0.25～9.85±0.18 μm，薄葉金花茶、毛籽金花茶、檸檬黃金花茶和弄崗金花茶的氣孔寬度相對較大，四個種之間差異不顯著；凹脈金花茶和四季金花茶，這兩種都顯著小于其它四種，且兩者間差異亦顯著；氣孔密度的變化范圍是149.64±5.00～246.57±4.47 個·mm-2，密度最高的是薄葉金花茶，除該種與凹脈金花茶兩者之間差異不顯著，其余各種之間差異均顯著。氣孔指數在12.98%～20.93%之間變化，四季金花茶最大，弄崗金花茶最小。

6 種金花茶葉表皮細胞密度都是上表皮大于下表皮，說明上表皮細胞普遍比下表皮細胞小，其中上表皮細胞密度變化范圍是2 002.77±31.68～3 266.90±48.09 個·mm-2，密度最高的是薄葉脈金花茶，最小的是弄崗金花茶，弄崗金花茶與檸檬黃金花茶間的上表皮細胞密度差異不顯著，其它種類之間差異顯著；下表皮細胞密度的變化范圍在802.64±21.73～1 550.87±28.27 個·mm-2，薄葉金花茶密度最大，而且與其余五種存在顯著差異，密度最小的是檸檬黃金花茶，除與四季金花茶間的差異不顯著外，與其它種類的差異顯著，凹脈金花茶、毛籽金花茶、弄崗金花茶，三者之間差異不顯著。

2.4 6種金花茶葉表皮數量特征聚類分析

聚類分析可根據遺傳距離的長短來分析各性狀指標之間的相關性，親緣關系較近的種類常聚為一類［19］，可用于優良性狀的選育工作。本研究采用上述6 個葉表皮數量特征進行Euclidean 距離聚類分析，從聚類樹狀圖可以看出弄崗金花茶和毛籽金花茶距離最小，表明兩者的親緣關系最近，四季金花茶與其它種的遺傳距離最大，表明其與它們的親緣關系最遠，其余種間的親緣關系位于之間。以類別最小相關系數為分類標準，6種野生金花茶可分為五類，其中弄崗金花茶（LO）和毛籽花茶（PT）聚為一類，距離系數為2.407，兩者在氣孔長、寬及下表皮細胞密度差異不顯著，同時兩者表皮細胞的蠟質紋飾、角質層紋飾及氣孔外蓋特征具有高度相似性，特別是下表皮角質層紋飾，兩者輻射狀粗條紋與其它種類的線狀紋飾具明顯區別，其余四種金花茶在各測量和觀察特征規律性不明顯，所以可自成一類（見圖4）。

3 討論

3.1 葉表皮微形態特征在植物分類中的應用

大量研究表明，葉表皮微形態特征是植物系統分類及演化趨勢分析的重要指標，無論是在種間、屬間，甚至是科級水平的分類上應用均有相關報道［17--24］，報道中涉及的常用指標主要有：表皮角質膜、蠟質飾紋、表皮細胞大小和形態、垂周壁式

樣、氣孔器類型、氣孔大小、密度、指數及氣孔蓋特征等。本研究用上述指標對6 種金花茶的研究結論與王任翔等人［14～16］的研究相比較，相同之處有：表皮細胞形狀不規則，垂周壁彎曲；氣孔僅分布于下表皮，氣孔器近圓形，具有3 個大小不一的副衛細胞，屬環列型氣孔。相同的結果一方面說明這些特征是金花茶組植物的共性，另一方面說明這些特征比較保守，受環境影響較小，可以考慮作為種以上水平的分類依據。研究結果差異較大的有：氣孔密度、氣孔外拱蓋角質膜和蠟質飾紋等特征。李鳳英等人［14～16］在研究金花茶組時這幾個指標也具有差異性。實際上除金花茶組植物外，其它植物類群中也有類似報道［22，25］，說明葉表皮這些屬性受環境影響較大，具有一定可塑性，在利用它們作為分類依據時要注意結合樣地環境因子綜合考慮。

除上述共性之處，本研究利用掃描電鏡觀察到6種金花茶葉表皮微形態還有各自的特征，對該六種金花茶分類有一定參考意義。如：凹脈金花茶葉下表皮蠟質紋飾有較長的鏈狀和絮狀紋飾；薄葉金花茶葉的氣孔外拱蓋角質層有多層，使得外拱蓋角質層平面呈淺波浪狀；檸檬黃金花茶葉下表皮蠟質飾紋的絲狀體最短；毛籽金花茶和弄崗金花茶上表皮的蠟質紋飾為長絲狀，并附有較多絮狀體或顆粒狀紋飾，但兩者在下表皮細胞的垂周壁式樣及氣孔密度上有一定差異；四季金花茶的氣孔外拱蓋角質層獨有兩層，蠟質紋飾除絲狀體外，上表皮的還有乳突結構，下表皮還有痂狀體結構。

角質層紋飾在不同類群間差異較大，常被研究者用來作為植物分類的重要指標［20，23，26］，本研究發現6 種金花茶葉表皮細胞上覆蓋的蠟質紋飾普遍具有長短不一的圓柱狀或鏈狀絲狀體，這是前期研究者沒有報道過的特征，可考慮作為野生種與栽培種金花茶組區分的依據。

3.2 6種金花茶的親緣關系

6 種金花茶葉表皮細胞及氣孔密度、大小等6個數量指標均存在不同程度的差異，差異顯著（P＜0.05）者在種間對比中可以作為分類的依據；用該6 個指標對6 種金花茶進行聚類分析，結果表明：毛籽金花茶和弄崗金花茶聚為一類，其余的4種各為1 類。相同或相近的特征意味著物種間具有較密切的親緣關系，不同特征的差異性表示種間親緣關系的遠近和進化的程度。毛籽金花茶和弄崗金花茶的葉表皮形態指標大部分較相似，特別是下表皮角質層輻射狀粗條紋紋飾明顯不同于其它四種，因此本研究支持將毛籽金花茶和弄崗金花茶歸并為一種的觀點［16，27］，施蘇華等［8］采用RAPD分子標記方法的研究也表明毛籽金花茶和弄崗金花茶的親緣關系較近，從遺傳學角度支持將兩者歸并。與這兩個種親緣關系較近的是凹脈金花茶，但就表皮細胞形狀來看，具有深波狀垂周壁的凹脈金花茶其進化程度要高于前兩者。四季金花茶因聚類距離系數的差距最大及其具有較多獨特的微形態特征，表明與其它五種間具有明顯的分化和較遠的親緣關系。其它兩種金花茶的親緣關系居于凹脈金花茶和四季金花茶之間。

3.3 金花茶葉表皮微形態特征與其環境適應性

葉片形態在某種程度上反映了植物對環境的適應性及環境對植物形態發育的調控結果。有研究已證實，葉片的微形態特征與植物的抗逆性有直接或間接關系［28～29］。本研究采樣地位于北回歸線以南，屬于典型的喀斯特地貌類型，土層淺薄、巖石裸露、表層儲水能力差，年平均溫度和年積溫較高，植物必須具有一定的保水能力才能在旱季生存和延續；從觀察中可以看到，6 種金花茶葉表皮均具有一些適應干旱環境的特征，具體反映在如下幾個方面：氣孔僅分布于下表皮，避免了光線直接照射，降低了植物對水分的蒸騰作用，利于對水分保存；葉片上表皮具有較明顯的角質層和蠟質層覆蓋，此兩類物質均為脂類化合物，既能減少葉片內部水分過渡流失，又不影響光線進入葉肉組織［30］，保障光合作用正常進行；表皮細胞壁均較厚，既能增強葉片支持力和致密度，同時可以削弱水分的滲透散發，防止葉片因缺水而萎蔫；部分種類的下陷氣孔也是減弱外界高溫氣流直接進入葉片內部的一種抗旱適應性特征。綜上所述，6種金花茶的葉片形態及結構特征對當地生態環境具有較好的適應策略，同時反映了其結構與功能的統一性。