桑抹茶對THP-1 源性泡沫細胞脂質沉積作用的實驗研究

王 英 朱發偉 樓招歡

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是冠心病等心腦血管病的關鍵病理基礎，脂質代謝異常是AS 發生發展的主要誘因[1]。膽固醇酯在巨噬細胞內過度堆積形成泡沫細胞是AS 的典型病理特征[2]，減少脂質在動脈管壁的沉積，能有效阻止AS 的發生發展。已知桑葉水提取物[3]、桑葉總黃酮[4]能有效減少脂肪積累，促進膽固醇代謝，預防AS 的發生發展。課題組前期研究結果顯示，由新鮮桑葉經特殊工藝制成的桑抹茶能有效降低高脂血癥模型大鼠血清膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平，提高血清高密度脂蛋白（HDL-C）水平，降低動脈硬化指數，上調高脂血癥模型大鼠胸主動脈肝X 受體α（LXRα）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）表達，改善血管病理改變[5]。提示桑抹茶可能通過促進膽固醇從動脈壁細胞流出，減少細胞內脂質沉積，發揮防治AS 作用[6]。本文擬在此基礎上，通過佛波酯誘導的THP-1 泡沫細胞模型[7-8]，觀察桑抹茶對巨噬細胞膽固醇攝取及沉積的作用，探討桑抹茶抗AS 的作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞株 THP-1 細胞（批號SCSP-567，中國科學院細胞庫）。

1.2 藥 物 桑抹茶（批號20180809，杭州沃亞生物科技有限公司），桑抹茶加10BV 水超聲30min，離心，取上清，重復2 次；減壓濃縮，凍干，即得。

1.3 試 劑 佛波肉荳蔻醋酸（PMA，5mg/mL，批號50601ES02，上海翊圣生物科技有限公司）；人源氧化低密度脂蛋白（Human Ox-LDL，2mg/mL，批號20605ES05），人源紅色熒光標記氧化型低密度脂蛋白（Human Dil-Ox-LDL，500μg，批號609ES76），均購自上海翊圣生物科技有限公司；RPMI1640 培養基（批號GNM-31800S，杭州吉諾生物）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，批號ST1537，碧云天）；總膽固醇（T-CHO）檢測試劑盒（批號A111-1，南京建成）；油紅O 染料（批號WSIG0100803，國藥集團化學試劑有限公司）；PPARγ 抗體（批號YM3443，ImmunoWay）、腺苷三磷酸結合盒轉運體A1（ABCA1）抗體（批號bs-1627R，博奧森）。

1.4 儀 器 BA410 生物顯微鏡、Adavance 3.2 圖像分析系統（Motic 公司），Ti-S、EVOS FL 熒光倒置顯微鏡（尼康），Milli-Q Synthesis A10 純水儀（美國MILLIPORE 公司），Power Wave 340 酶標儀（美國Bio-TeR）。

2 實驗方法

2.1 THP-1 源性泡沫細胞模型制備 THP-1 單核細胞生長于含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液中，37℃、5% CO2培養箱中靜置培養。每48～72h傳代1 次。取對數生長期細胞進行實驗，以1×105cell/mL 點96 孔板，每孔200μL 體積，實驗前用160nmol/L 佛波酯孵育THP-1 單核細胞24h，使其誘導分化成巨噬細胞。待其貼壁生長融合至80%左右，換含0.3% BSA 的無血清培養液培養，給予50μg/mL Ox-LDL 處理48h。

2.2 MTT 法檢測桑抹茶對THP-1 源性泡沫細胞增殖活力的影響 實驗分為正常對照組：佛波酯誘導的THP-1 源性巨噬細胞，模型對照組：佛波酯+Ox-LDL 誘導的THP-1 源性泡沫細胞；藥物干預組：THP-1 源性泡沫細胞+不同濃度（10、20、40、80、160、320、640μg/mL）桑抹茶提取物；同時設RPMI 1640培養基為空白對照。藥物干預組培養液中加入不同濃度桑抹茶水提物干預24h，其余各組加入培養基干預24 后，加20μL MTT 孵育4h，加入DMSO 150μL震蕩10min，于570nm 處測定吸光度A570，以對照組調零，細胞存活率=（加藥組平均A 值/正常對照組平均A 值）×100%。

2.3 油紅O 染色觀察細胞內脂質沉積 將THP-1細胞培養于放有蓋玻片的6 孔培養板內，細胞被誘導分化為巨噬細胞后貼壁生長于培養板。換含0.3%BSA 的無血清培養基培養3h，再予以高、中、低濃度的桑抹茶提取物（93、186、372μg/mL）處理24h 后加入Human Ox-LDL，使其終濃度為20μg/mL，置于37℃、5% CO2培養箱中培養6h 后，用PBS 液沖洗3次，每次5min；4%多聚甲醛固定10min，油紅O 染色液染色10min，棄上清，60%異丙醇清洗1 次，再用PBS 洗滌3 次，顯微鏡觀察并拍照。采用Image J 1.46r（Wayne Rasband National Institutes of Health，USA）圖像分析系統對油紅O 染色結果進行半定量分析。

2.4 熒光顯微鏡下觀察THP-1 源性巨噬細胞內吞Ox-LDL 的變化 取THP-1 細胞，分為THP-1 源性泡沫細胞組、THP-1 源性泡沫細胞+不同濃度桑抹茶提取物作用組（93、186、372μg/mL）；將THP-1 細胞培養于放有蓋玻片的6 孔培養板內，細胞被誘導分化為巨噬細胞后貼壁生長于培養板。換含0.3%BSA的無血清培養基培養3h，再予以不同濃度的桑抹茶提取物（93、186、372μg/mL）處理24h，然后加入Human Dil-Ox-LDL，使其終濃度為20μg/mL，置于37℃、5% CO2培養箱中培養6h，PBS 洗滌3 次，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.5 Western blot 法檢測PPARγ、ABCA1 蛋白表達水平 實驗分組及處理同“2.3”。收集各組細胞，用預冷的PBS 緩沖液洗滌3 次，按細胞膜蛋白抽提試劑盒提取膜蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。50μg 膜蛋白樣品與上樣緩沖液按比例混合后煮沸5min，SDS-PAGE 電泳，WB 濕法轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2h，TBST 漂洗3 次后分別加入一抗和GAPDH，4℃孵育過夜，TBST 漂洗3 次，37℃二抗反應2h，進行ECL 顯色。以GAPDH 為內參，計算各處理組目的蛋白的相對表達量。

2.6 統計學方法 應用SPSS 16.0 統計軟件分析數據，計量資料數據以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析，兩組間比較采用t-test，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 桑抹茶對THP-1 源性泡沫細胞增殖活力的影響 細胞增殖活力檢測結果顯示（見表1），在10～160μg/mL 范圍內，隨著濃度的增加，桑抹茶提取物對THP-1 源性巨噬細胞活性的抑制作用逐漸增強（P＜0.05），至200μg/mL 后相對平緩；桑抹茶提取物對THP-1 源性巨噬細胞抑制作用的IC50 為186.7μg/mL。

3.2 桑抹茶對THP-1 泡沫細胞內脂質沉積的影響圖1 結果顯示，與未經Ox-LDL 處理的細胞相比，佛波酯+Ox-LDL 處理的THP-1 源性巨噬細胞內脂質沉積（紅染）明顯，提示泡沫細胞形成；桑抹茶提取物呈濃度依賴性地降低THP-1 泡沫細胞脂質沉積程度（P＜0.01），見表2。

表1 各組細胞活力比較（%）

表1 各組細胞活力比較（%）

注：Ox-LDL 為氧化低密度脂蛋白；與對照組比較，aP＜0.05；與Ox-LDL模型組比較，bP＜0.05

表2 各組細胞內脂質水平比較（IOD/Area）

表2 各組細胞內脂質水平比較（IOD/Area）

注：Ox-LDL 為氧化低密度脂蛋白；與對照組比較，aP＜0.01；與Ox-LDL模型組比較，bP＜0.01；與Ox-LDL+桑抹茶93μg/mL 組比較，cP＜0.05；n為實驗次數

3.3 桑抹茶對THP-1 源性巨噬細胞內吞Ox-LDL的影響 熒光顯微鏡觀察結果顯示，給予桑抹茶提取物預處理，能濃度依賴地抑制THP-1 源性泡沫細胞對Ox-LDL 的攝取，減少細胞內脂質沉積，見圖2。

圖1 桑抹茶提取物對THP-1 源性巨噬細胞內脂質沉積的影響（油紅O 染色×200）

圖2 桑抹茶提取物對THP-1 源性巨噬細胞內吞Ox-LDL 的變化（×200）

3.4 桑抹茶對THP-1 泡沫細胞PPARγ、ABCA1 蛋白表達水平的影響 Western blot 結果顯示，與對照組比較，THP-1 泡沫細胞ABCA1 蛋白表達增加，PPARγ 蛋白表達水平顯著降低；與模型組比較，桑抹茶提取物能濃度依賴地增加THP-1 源性泡沫細胞ABCA1、PPARγ 蛋白表達水平（P＜0.01），見圖3，表3。

圖3 各組細胞ABCA1、PPARγ 蛋白表達

表3 各組細胞ABCA1、PPARγ 蛋白表達量比較（）

表3 各組細胞ABCA1、PPARγ 蛋白表達量比較（）

注：Ox-LDL 為氧化低密度脂蛋白；ABCA1 為腺苷三磷酸結合盒轉運體A1；PPARγ 為過氧化物酶體增殖物激活受體γ；n 為實驗次數；與對照組比較，aP＜0.01；與Ox-LDL 模型組比較，bP＜0.01；與Ox-LDL+桑抹茶93μg/mL 組比較，cP＜0.01；與Ox-LDL+桑抹茶186μg/mL 組比較，dP＜0.01

4 討論

已知血脂代謝異常是動脈粥樣硬化的重要誘因。由異常升高的低密度脂蛋白（LDL）氧化修飾形成的氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）侵入并沉積于血管內膜，損傷內皮細胞，觸發炎癥反應；而由單核細胞黏附并活化的巨噬細胞通過清道夫受體CD36 和A 類1 型清道夫受體（SR-AI）吞噬Ox-LDL 形成泡沫細胞，促進AS 發生發展[9-10]。穩定的泡沫細胞模型對AS 發生發展及藥物干預作用機制研究至關重要。人源THP-1 和鼠源RAW264.7 巨噬細胞是Ox-LDL 誘導的泡沫細胞常用的兩種巨噬細胞[11]，其中Ox-LDL 誘導的THP-1巨噬細胞泡沫細胞模型常應用于細胞脂質代謝異常[12]、凋亡[13]等的研究。本研究結果顯示，Ox-LDL 處理的THP-1 源性巨噬細胞內紅色脂質明顯增多，表明泡沫細胞形成；予以桑抹茶提取物干預，能有效減少Ox-LDL 的攝取，降低THP-1 泡沫細胞內脂質沉積。提示桑抹茶可能具有預防AS 發生的作用。

膽固醇逆轉運（reverse cholesterol transport，RCT）是血脂代謝的中心環節[14]，外周組織ABCA1 和三磷酸腺苷結合腺聯（ABCG1）介導細胞膽固醇外流[15]，是RCT 的起始步驟。血管中的ABCA1 可經PPARα/γ-LXRα-ABCA1 正向調控表達[16]；在膽固醇逆轉運蛋白載脂蛋白（ApoE）、ABCA1 等作用下，膽固醇可從細胞內流向細胞膜并轉運至細胞外[17]，能有效減少膽固醇在血管壁的堆積，阻斷AS 的發生發展[18]。PPARγ 通過降低清道夫受體（SR-A）的表達、增強CLA/SR-BI、ABCA1 等的表達，促進細胞內膽固醇流出，負調控泡沫細胞形成[19-20]。已知Ox-LDL 能誘導THP-1 巨噬細胞分泌白介素（IL）-10、IL-1β 等炎癥因子，誘發炎癥反應[11]；AS 早期，PPARγ 表達上調能抑制血管壁單核/巨噬細胞介導的炎癥反應，阻斷AS的進展[21]。課題組前期在桑抹茶抗高脂血癥作用研究中發現，給予桑抹茶干預，能促進高脂血癥模型大鼠胸主動脈血管LXRα、PPARγ 表達水平，改善血管病變[7]。本研究結果也證實，桑抹茶提取物能增加THP-1 源性巨噬細胞膽固醇逆轉運蛋白ABCA1 及PPARγ 的表達，減少細胞內脂質沉積。提示桑抹茶可能可以通過抑制血管壁巨噬細胞膽固醇沉積，促進膽固醇從細胞壁流出，改善Ox-LDL 誘導的炎癥反應，阻斷AS 的發生發展。