紫草素對腎透明細胞癌抗凋亡作用與機制研究

沃奇軍 項 飛 張大宏

腎細胞癌是起源于腎實質泌尿小管上皮系統的惡性腫瘤，又稱腎腺癌，占腎惡性腫瘤的80%～90%，是泌尿系統最常見惡性腫瘤之一[1-2]。腎細胞癌的發病機制至今尚不明確，而放化療藥物在臨床使用過程中均不敏感，導致患者整體生存率無法提高[3]。腫瘤細胞的抗凋亡是放化療藥物不敏感的重要因素，腫瘤細胞的凋亡分為多種，而在腎細胞癌中，抗失巢凋亡是腎細胞癌轉移過程中的關鍵因素[4-5]。近年研究表明，許多中藥在抗腫瘤治療中發揮重要作用[6-7]。此前研究發現，紫草提取物紫草素在多種腫瘤中具有顯著的抗腫瘤作用[8-17]。本研究探究紫草素對腎細胞癌凋亡和抗失巢凋亡的可能作用及機制。

1 實驗材料

1.1 細胞株 786-O [786-0]人腎細胞腺癌細胞（2019 年新引進）由中國科學院干細胞庫提供。培養于10%FBS 的DMEM 培養基中，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2 中 藥 紫草素（批號5156421）購自成都曼斯特生物科技有限公司。將紫草素利用PBS 溶解成1mg/mL 儲液于-80℃保存。低劑量組設置為1μg/mL，中劑量組設置為2μg/mL，高劑量組設置為4μg/mL。對照組加入相應體積的PBS。

1.3 試 劑 CCK8 細胞活力檢測試劑盒（批號265189）購自北京索萊寶科技有限公司；軟瓊脂（批號87183）購自北京擎科新業生物技術有限公司；poly-HEMA（批號2316a）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；PI-Annexin V 凋亡檢測試劑盒（批號237236）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；局部粘著斑激酶（FAK，批號454683）、磷酸化局部粘著斑激酶（p-FAK，批號252454）、蛋白激酶B（Akt，批號54861）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt，批號564684）、Src 蛋白（Src，批號2487）、磷酸化Src 蛋白（p-Src，批號483452）、糖原合酶激酶3β（GSK3b，批號68a326）、磷酸化糖原合酶激酶3β（p-GSK3b，批號65821）單抗均購自CST，actin 作為內參。

2 實驗方法

2.1 CCK8 檢測腎透明癌細胞活力 將紫草素溶液786-O 人腎細胞腺癌細胞消化計數后按2000/孔鋪板于96 孔板中。紫草素溶液分為四組，分別為對照組、低劑量組（1μg/mL）、中劑量組（2μg/mL）和高劑量組（4μg/mL），每組5 個復孔。細胞鋪板生長過夜后加入紫草素，48h 后檢測加入CCK8 孵育2h，測定450nmol 處吸光度值。

2.2 軟瓊脂細胞集落實驗 同上分為四組，將藥物與DMEM 稀釋的軟瓊脂稀釋液混合后重懸消化離心的細胞，細胞密度設置為2000 個/mL。鋪板于24孔板中，37℃培養7 天后取出拍照，每組設置10 個復孔，每個復孔選取5 個視野計算細胞集落數。細胞數＞30 記為一個集落。

2.3 Poly-HEMA 細胞條件培養 同上實驗分為4組，將poly-HEMA 2mL 加入6 孔板中，37℃保存，10min 后加入786-O 人腎細胞癌單細胞懸液。24h 后觀察細胞聚團情況。

2.4 流式細胞術檢測786-O 人腎細胞癌細胞凋亡將收集的786-O 人腎細胞癌細胞用PBS 稀釋至5×106個/mL。按照PI-Annexin V 凋亡檢測試劑盒說明書進行后續操作。

2.5 細胞caspase-3 活力檢測 將786-O 腎透明細胞癌細胞消化計數后接種在鋪有膠原蛋白或非粘附性poly-HEMA 的96 孔板上，包括空白組（只含培養基），對照組，低、中、高劑量組，陽性對照組[暴露于TRAIL（100ng）+Velcade（100nmol/L）處理16h]，于37℃培養箱孵育6～24h。根據Caspase-Glo 3/7 測定法用試劑盒檢測caspase-3 的活化。主要步驟為在開始測定之前，準備Caspase-Glo 3/7 試劑，使試劑平衡至室溫，拌勻。從培養箱中取出裝有已處理細胞的96 孔板，平衡至室溫。將100μL Caspase-Glo 3/7 試劑加到96 孔板的每個孔中。在平板振蕩器中以300～500rpm 輕輕混合溶液30s，在室溫下孵育2h 后進行照度計讀數。

2.6 Western blot 檢測FAK、Akt、Src、GSK3b 蛋白磷酸化情況 收集藥物處理48h 的細胞，裂解蛋白測定蛋白濃度，加入6X loading，100℃煮10min 后上樣。每孔蛋白上樣量20μg，經過SDS-PAGE 電泳后，轉膜封閉，4℃過夜孵育一抗（一抗稀釋比均為1:1000）。TBST 洗膜后孵育熒光二抗1h，在odyssey熒光掃膜儀進行顯影。

2.7 RT-PCR 檢測FasL、Bim mRNA 表達 將高劑量紫草素處理48h 的細胞，通過trizol 法提取細胞RNA 后逆轉為cDNA，使用SYBR Green 法進行熒光定量PCR。PCR 程序為：95℃預變性5min；95℃變性15s；60℃退火30s；72℃延伸15s。以GAPDH 作為內參。引物購自北京擎科新業生物技術有限公司，引物詳細序列如下：GAPDH（上游引物：5' TGTGGGCATCAATGGATTTGG 3'；下游引物：5' ACACCATGTATTCCGGGTCAAT 3'）、FasL（上游引物：5' TGCCTTGGTAGGATTGGGC 3'；下游引物：5' GCTGGTAGACTC-TCGGAGTTC 3'）、Bim（上游引物：5' CATATAACCCCGTCAACGCAG 3'；下游引物：5' GCAGCCGCCACAAACATAC 3'）。

2.8 統計學方法 應用GraphPad Prism 6 軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 紫草素對腎透明細胞癌細胞活力的影響 與對照組比較，中、高劑量紫草素均能顯著抑制腎透明細胞癌細胞活力（P＜0.01）。見表1。

3.2 紫草素對集落形成的影響 與對照組比較，紫草素低、中、高劑量組細胞集落數明顯減少（P 均＜0.01），且呈劑量依賴性下降。見表2。

3.3 紫草素對poly-HEMA 條件下細胞聚集的影響 786-O 腎透明細胞癌細胞在Poly-HEMA 中，分別加入低、中、高劑量的紫草素培養24h，在倒置微鏡下觀察細胞形態，可觀察到對照組細胞大部分成團聚集，而低、中、高劑量組細胞聚團減少，尤其在高劑量紫草素處理后，細胞幾乎不形成聚團。見圖1。

表1 CCK8 檢測各組細胞活力比較（%，）

表1 CCK8 檢測各組細胞活力比較（%，）

注：對照組為PBS 處理24h；低劑量組為1μg/mL 紫草素處理24h；中劑量組為2μg/mL 紫草素處理24h；高劑量組為4μg/mL 紫草素處理24h；與對照組比較，aP＜0.01

表2 各組細胞集落數比較（個，）

表2 各組細胞集落數比較（個，）

注：對照組為PBS 處理24h；低劑量組為1μg/mL 紫草素處理24h；中劑量組為2μg/mL 紫草素處理24h；高劑量組為4μg/mL 紫草素處理24h；與對照組比較，aP＜0.01

圖1 紫草素對腎透明細胞癌細胞聚集的作用

3.4 紫草素對poly-HEMA 條件下細胞凋亡的影響低劑量組（8.04±0.98）%、中劑量組（19.35±1.22）%及高劑量組（35.25±1.35）%與對照組（0.40±0.52）%比較差異均有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖2。

3.5 紫草素對caspase-3 活力的影響 紫草素處理鋪于膠原蛋白上的786-O 腎透明細胞癌細胞能明顯降低caspase-3 活力（P＜0.05，P＜0.01）。同時鋪板于非粘附性poly-HEMA 的細胞caspase-3 活性也隨著紫草素劑量的增加而增加（P＜0.05，P＜0.01）。見表3-4。

圖2 紫草素對腎透明細胞癌失巢凋亡的作用

表3 紫草素對粘附生長腎透明細胞癌caspase-3 活力的影響（）

表3 紫草素對粘附生長腎透明細胞癌caspase-3 活力的影響（）

注：空白組為只含培養基；對照組為PBS 處理24h；低劑量組為1μg/mL紫草素處理24h；陽性對照組為TRAIL（100ng）+Velcade（100nmol/L）處理16h；中劑量組為2μg/mL 紫草素處理24h；高劑量組為4μg/mL紫草素處理24h；與對照組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

表4 紫草素對非粘附生長腎透明細胞癌caspase-3 活力的影響（）

表4 紫草素對非粘附生長腎透明細胞癌caspase-3 活力的影響（）

注：空白組為只含培養基；對照組為PBS 處理24h；低劑量組為1μg/mL紫草素處理24h；陽性對照組為TRAIL（100ng）+Velcade（100nmol/L）處理16h；中劑量組為2μg/mL 紫草素處理24h；高劑量組為4μg/mL紫草素處理24h；與對照組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

圖3 紫草素抑制786-O 腎透明細胞癌FAK/Akt/Src/GSK3b信號活化

3.6 紫草素對FAK、Akt、Src、GSK3b 信號激活的影響 Western blot 結果顯示，紫草素能明顯降低786-O 腎透明細胞癌細胞FAK、Akt、Src、GSK3b 的磷酸化激活，與對照組比較均有顯著性差異，且信號軸活化水平與紫草素的濃度存在劑量依賴性。見圖3。

3.7 紫草素對凋亡信號靶基因FasL、Bim 表達的影響 高劑量紫草素能明顯降低FasL、Bim 轉錄水平（P＜0.01）。見表5。

表5 FasL、Bim 轉錄水平相對表達量比較（）

表5 FasL、Bim 轉錄水平相對表達量比較（）

注：對照組為PBS 處理24h；高劑量組為4μg/mL 紫草素處理24h；與對照組比較，aP＜0.01

4 討論

目前臨床腎細胞癌的治療策略以放化療為主，但是腎細胞癌對放療和化療均不敏感的問題一直存在，其中一個重要的原因即腎細胞癌異常的抗凋亡能力[11，13]。

紫草素在眾多腫瘤的治療中發揮重要作用[8-12]。本研究通過CCK8 實驗檢測發現，紫草素能有效抑制腎細胞癌細胞活力。進一步通過軟瓊脂細胞集落實驗和poly-HEMA 條件培養發現紫草素能明顯抑制腎透明細胞癌細胞失巢凋亡抵抗的能力。且這種作用具有劑量梯度依賴性。本研究發現，低、中、高劑量的紫草素均能明顯促進癌細胞的凋亡，進一步明確了紫草素對腎細胞癌抗凋亡能力的抑制作用。事實上，紫草素的抗凋亡作用在其他腫瘤中也存在類似的研究，Wu 等[14]發現，低劑量紫草素能誘導黑色素瘤細胞caspase 信號活化，促進細胞發生凋亡，此外紫草素對肺癌、前列腺癌等多種細胞也有類似的作用[15]。因此，對紫草素的進一步體內研究將有利于促進紫草素成為新型腫瘤治療潛在藥物。

經典的細胞凋亡分子機制為p53 激活促凋亡蛋白Bax，Bax 導致細胞色素C 的釋放和caspase 的活化[16]。本研究發現抑制紫草素能明顯升高腎細胞癌在貼壁和懸浮狀態下caspase-3 活性。同時通過檢測抗凋亡相關信號FAK、Akt、Src、GSK3b 的磷酸化激活，紫草素作用后明顯抑制了相關信號的激活，通過對凋亡信號下游靶基因表達的定量檢測我們發現下游靶基因FasL、Bim 促凋亡分子的表達明顯升高，提示紫草素可能通過抑制抗凋亡信號并增強促凋亡信號達到抑制腎細胞癌的作用。