蒙花苷對MDA-MB-231細胞雄激素受體的影響

★ 左志琴 沈志華,2（.深圳市中醫院 廣東 深圳 58040；2.江西中醫藥大學 南昌 330004）

乳腺癌是全球女性中最常見的癌癥類型，每年影響數百萬女性［1］。乳腺癌病例中有15 %～20 %被診斷為三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）［2］。臨床上，TNBC被定義為雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progesterone receptor，PR）陰性且缺乏HER2的腫瘤。與激素受體和HER2陽性乳腺癌不同，TNBC 的治療具有挑戰性［3］。由于細胞分化差、分子異質性和快速轉移，該病通常會產生化學耐藥性［4］?？焖購桶l、侵襲性強和預后較差是TNBC腫瘤的常見特征［5］。因此，迫切需要開發和優化TNBC的靶向治療。最近，研究證實TNBC患者可表達雄激素受體（androgen receptor，AR），進行抗AR治療可獲益，且AR可以作為TNBC的治療靶點［6-8］。密蒙花黃酮類化合物結構與雄激素類似，可以發揮擬雄激素效應。前期發現密蒙花主要成分蒙花苷對MCF-7細胞的AR具有調節作用［9］。在此基礎上，研究蒙花苷對三陰性乳腺癌細胞株MAD-MB-231細胞AR的表達和細胞遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 MDA-MB-231細胞株購買于中國科學院細胞庫，目錄號：TCHu227。蒙花苷（購自于上海源葉生物科技有限公司，批號：Z04A9L57508）。CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所，批號：TD826），反轉錄試劑盒（TAKARA，Cat# RR036A）。全自動酶標儀（RT-6000，Rayto）；臺式高速離心機（5417R，德國Eppendorf）；Real-time PCR System（ABI 7500，美國ABI公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCK-8檢測蒙花苷對MDA-MB-231細胞活力的影響［9］細胞常規培養，干預組用蒙花苷（2.0，6.7，20.0，66.7，100.0 μg/mL）作用于細胞，對照組為正常條件培養的細胞，CCK-8法檢測細胞活力，細胞增殖率（%）=（實驗組-對照組）/對照組×100 %。

1.2.2 蒙花苷對MDA-MB-231細胞AR mRNA表達的影響［9］干預組用蒙花苷（2.0，6.7，20.0，66.7，100.0 μg/mL）作用于細胞，對照組為正常條件培養的細胞，Real-time PCR檢測細胞AR mRNA表達。按RNA 抽提試劑盒步驟提取總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，取500 ng RNA 按反轉錄試劑盒步驟進行逆轉錄反應合成第一鏈cDNA（RT）。AR引物設計：上游：5-GGGCGAAGTAGAGCATCCT-3，下游：5-GACGACCAGATGGCTGTCATT-3。內參引物GAPDH設計：上游：5-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3，下游：5-CTGGGCTACACTGAGCACC-3。由北京六合華大基因科技有限公司公司合成。擴增完畢后，進入結果分析界面，以GHPD為內參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達的相對定量值（RQ值），將RQ值用于統計分析。

1.2.3 蒙花苷對MDA-MB-231細胞遷移的影響干預組用蒙花苷（6.7，20.0，66.7 μg/mL）作用于細胞，對照組加入DMSO，按每孔4×105個接種至6孔板中，37 ℃、5 % CO2培養箱中培養。待細胞鋪滿后，用200 μL移液器槍頭沿著孔板的中間直線劃痕，用培養液沖洗掉劃下的細胞，加入新鮮無血清培養基培養24 h。按0、24 h拍照記錄，測量劃痕間距d，并進行計算，劃痕愈合率（%）=（d0h-d24h）/d0h×100 %。

1.3 統計學分析 應用運用SPSS 22.0軟件進行統計，所有結果用（±s）來表示。多組間的比較采用完全隨機設計的方差分析。兩組間的比較，采用t檢驗；所有統計檢驗均采用雙側檢驗。結果以P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 蒙花苷對MDA-MB-231細胞活性的影響 與對照組比較，干預組（蒙花苷2.0，6.7，20.0，66.7 μg/mL）作用24 h后細胞OD值差異不明顯（P>0.05），說明細胞活力無明顯下降，各蒙花苷濃度組組間差異也不明顯（P>0.05）。隨蒙花苷作用時間延長和濃度增加，細胞活力呈下降趨勢，尤其是當蒙花苷濃度為100 μg/mL時，作用24 h后，OD值較對照組升高，但差異不明顯（P>0.05）。作用48 h后，與對照組相比，差異有統計學意義（P>0.05）。作用72 h后，差異有顯著意義（P<0.01）。說明蒙花苷對細胞活力的影響與濃度和作用時間有關，且當作用24 h后影響最小。見表1。

表1 蒙花苷不同濃度和作用時間的對MDA-MB-231細胞活力的影響（±s，n=7）

表1 蒙花苷不同濃度和作用時間的對MDA-MB-231細胞活力的影響（±s，n=7）

注：與對照組比較，△P＜0.05，◆P<0.01。

組別 濃度/μg·mL-1 24 h 48 h 72 h對照組0.0 0.21±0.02 0.34±0.02 0.47±0.03 2.0 0.22±0.04 0.34±0.01 0.48±0.01 6.7 0.22±0.02 0.35±0.04 0.51±0.10蒙花苷干預組20.0 0.23±0.03 0.36±0.04 0.56±0.07△66.7 0.23±0.02 0.37±0.06 0.56±0.03△100.0 0.25±0.01 0.42±0.01△ 0.59±0.06◆

2.2 蒙花苷對AR mRNA表達的影響 正常MDAMB-231細胞有AR mRNA表達，經蒙花苷處理細胞后，AR mRNA表達隨濃度增加呈增多趨勢。當蒙花苷濃度為6.7 μg/mL時，AR mRNA表達明顯增加，與正常組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。當濃度為20.0μg/mL 和66.7 μg/mL時，AR表達最高，與正常組相比，差異有統計學意義（P<0.01）。隨后，隨濃度增加（100.0 μg/mL），AR mRNA表達減少，但較正常組表達升高，差異無統計學意義。見表2。說明蒙花苷對MDA-MB-231細胞AR的表達有促進作用。由于蒙花苷濃度為200.0 μg/mL時可見結晶現象［9］，濃度為100.0 μg/mL時MDAMB-231細胞活力稍有下降，且此時AR mRNA表達較濃度為6.7，20.0，66.7 μg/mL時減少，結合蒙花苷高濃度對細胞有毒性作用，后期實驗舍棄該濃度（100.0 μg/mL）。見圖1。

表2 蒙花苷對MDA-MB-231細胞 AR mRNA表達的影響（±s，n=3）

表2 蒙花苷對MDA-MB-231細胞 AR mRNA表達的影響（±s，n=3）

注：與對照組比較，△P<0.05。

組別 濃度/μg·mL-1 AR mRNA對照組0.0 1.00 2.0 0.98±0.10 6.7 1.11±0.04△蒙花苷干預組20.0 1.13±0.03△66.7 1.14±0.04△100.0 1.02±0.06

圖1 蒙花苷對MDA-MB-231細胞AR mRNA表達的影響

蒙花苷對MDA-MB-231細胞遷移的影響 對照組MDA-MB-231細胞加入含DMSO的新鮮無血清培養基培養24 h后，細胞劃痕間距明顯縮小，與0 h相比，差異明顯（P<0.01），說明細胞愈合能力強。蒙花苷（6.7，20.0，66.7 μg/mL）作用于細胞24 h后，劃痕間距較0 h也明顯縮小，差異有統計學意義（P<0.01）。見表3。說明MDA-MB-231細胞侵襲能力強。各蒙花苷干預組與對照組相比，細胞愈合能力明顯抑制（P<0.01），隨著蒙花苷濃度逐漸增高，抑制細胞愈合逐漸增強，且當濃度為66.7 μg/mL，抑制細胞愈合能力最強，與濃度6.7，20.0 μg/mL相比，差異有統計學意義（P<0.05）。說明蒙花苷對細胞的遷移能力與蒙花苷濃度有關。見圖2。

表3 蒙花苷對MDA-MB-231細胞遷移的影響（±s，n=6）

表3 蒙花苷對MDA-MB-231細胞遷移的影響（±s，n=6）

注：與本組治療前比較，▲P<0.01；與對照組治療后比較，△P<0.01；與蒙花苷6.7 μg/mL干預組比較，◆P<0.05；與蒙花苷20 μg/mL干預組比較，#P<0.05。

組別 濃度 創面寬度/μm 0 h 24 h對照組 - 451.91±35.23 202.64±11.00▲6.7 μg/mL 444.16±45.98 300.39±7.19▲△蒙花苷干預組 20 μg/mL 451.10±103.65 312.23±19.83▲△66.7 μg/mL 466.80±67.84 356.30±11.53▲△◆#

圖2 蒙花苷對MDA-MB-231細胞遷移的影響

3 討論

AR是類固醇激素受體家族的成員，該家族還包括雌激素、孕激素、糖皮質激素和鹽皮質激素受體。在乳腺癌中，AR的表達比ER或PR更廣泛，原發性和轉移性乳腺腫瘤中超過70 %的AR表達［7］。TNBC 腫瘤的一個子集表達 AR，并且可能受益于抑制 AR 信號通路的治療。并且AR 最近已成為進一步細化乳腺癌亞型分類的有用標記［10-12］，AR 表達與分化良好的狀態和更多惰性乳腺癌相關［13-14］。這意味著AR可能是AR陽性乳腺癌患者的新標志物和潛在治療靶點。

MDA-MB-231細胞是一種眾所周知的TNBC細胞系，具有高度侵襲性，表現出快速的腫瘤生長，并且具有高度轉移性，通常用作體外模型來研究各種藥物對乳腺癌細胞遷移的影響和作用機制，可作為一種研究AR在三陰性乳腺癌中生物學特性的細胞模型。本研究MDA-MB-231細胞為目標細胞，觀察三陰性乳腺癌細胞中是否有AR表達，結果發現正常MDA-MB-231細胞有AR mRNA表達，這與Yan Kong等［15］的研究結果相似。

前期觀察蒙花苷對乳腺癌細胞MCF-7AR的影響，發現蒙花苷對MCF-7AR具有雙向調節作用，AR mRNA 呈先升高后降低趨勢，并發現蒙花苷濃度為200 μg/mL時可見結晶現象［9］。故本實驗在此基礎上，進一步觀察中藥密蒙花主要成分蒙花苷不同濃度（0.0，2.0，6.7，20.0，66.7，100.0 μg/mL）對MDA-MB-231細胞AR的影響。首先觀察蒙花苷對MDA-MB-231細胞活力的影響，結果顯示，蒙花苷作用24 h對MDA-MB-231細胞活力無明顯抑制作用，這與蒙花苷對MCF-7細胞活力無明顯抑制作用的結果相似［9］。但隨蒙花苷作用時間延長和濃度增加，細胞活力呈下降趨勢。隨后，觀察蒙花苷對AR的影響，結果顯示正常MDA-MB-231細胞有AR mRNA表達，且ARmRNA表達水平隨蒙花苷濃度逐步增加呈增多趨勢。這說明蒙花苷對MDA-MB-231細胞乳腺癌細胞株中雄激素受體的表達具有正性調節作用。該結果與蒙花苷對MCF-7 AR mRNA表達呈先升高后降低趨勢不一致［9］，考慮蒙花苷對乳腺癌細胞AR的調節與乳腺癌細胞類型有關，提示后期運用中藥密蒙花治療乳腺癌需根據乳腺癌類型來選擇治療濃度。在此基礎上，進一步觀察蒙花苷對MDA-MB-231細胞遷移的影響，發現對照組24 h后劃痕間距明顯縮小，蒙花苷作用后，MDA-MB-231細胞的侵襲能力得到抑制，且隨濃度增高，抑制能力增強。當濃度為66.7 μg/mL，抑制細胞愈合能力最強。結合蒙花苷對MDA-MB-231細胞AR mRNA表達呈正相關，考慮蒙花苷對MDA-MB-231細胞遷移能力的抑制作用與蒙花苷促進MDA-MB-231細胞表達AR有關。該結果同時也佐證了AR可作為乳腺癌的治療靶點［6-8］。

綜上，密蒙花能夠調節乳腺癌細胞AR的表達，且對三陰性乳腺癌AR的表達密蒙花濃度呈正相關，并呈濃度依賴性抑制三陰性乳腺癌細胞的遷移。然而，中藥密蒙花如何影響三陰性乳腺癌的生長、轉移的機制尚不明確。