菟絲子提取物對失眠大鼠血清細胞因子及SOD、MDA的影響

★ 劉海云 方永青 何志堅 伍慶華 宋渺渺 林倩霞 侯本超（.江西中醫藥大學中醫學院 南昌 0004；.江西省腫瘤醫院 南昌 009；.南昌大學第一附屬醫院 南昌 0006）

隨著生活壓力逐漸增加，失眠的人數量越來越多。據調查，失眠癥發生率為10 %～60 %，因地區不同而概率不同，老年人患上失眠癥一般在30 %～40 %之間,但在某些地區甚至可以達到90 %以上［1］。失眠癥的主要表現為夜間時無法入睡, 長久的失眠會引起機體免疫力下降，記憶力、注意力等認知功能損害，同時持續失眠還會增加很多慢性基礎性疾病的風險［2-3］。

研究顯示，睡眠剝奪能加快機體新陳代謝，增加自由基，降低超氧化物歧化酶（SOD）活性，并形成大量脂質過氧化物丙二醛（MDA）［4］。長期睡眠剝奪病理表現的突出特征為能量消耗過多，在此過程中常產生大量活性氧，大量的氧自由基堆積，當這些含氧物超過機體的抗氧化能力將引發氧化應激反應。肖愛嬌等［5］研究發現熱敏灸可以通過調節SOD、MDA的含量恢復機體的氧化平衡狀態 ，達到改善睡眠的作用。吳北峰［6］發現采用電項針療法可以降低腦干內SOD和NO的含量，能夠降低氧化應激所導致的能量過度消耗水平，減少氧化應激對腦干的損害，恢復正常睡眠-覺醒周期。

細胞因子不但是重要的免疫調節因子，而且具有廣泛的中樞調節作用 ，它們不僅在外周血液單核細胞中釋放并存在，而且外周神經和大腦中也存在。因此，細胞因子能通過不同線路影響中樞神經系統的睡眠過程［7］。

目前，對于失眠臨床上常用的藥物副作用比較大，有成癮性和依賴性。因此，尋找一種有效而副作用小的藥物預防和治療失眠是當務之急。

菟絲子最初記載于《神農本草經》，又被稱為菟絲實、吐絲子等。菟絲子味甘、辛，性平，是常用的補益中藥，具有補肝腎、固精縮尿、益精明目等功效，是中醫補腎、壯陽、固精之要藥［8］。課題組對菟絲子的研究較多，但在失眠方面還未涉及。前期實驗結果證實，菟絲子可以改善失眠大鼠的學習記憶能力，對改善失眠有顯著效果［9］，但其作用機制不清楚?，F從細胞因子及氧化應激的角度進一步探討中藥菟絲子對失眠大鼠的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠60只，雌雄各30只，體重（200±20）g，購于北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號 SCXK（京）2016-0011。動物飼養室溫為20～22 ℃。室內外空氣交換迅速，通風良好。將大鼠雌雄分開于不同的飼養籠中，使用專用的大鼠飼料喂養，自由飲水。在正式的實驗開始之前先飼養一至兩周。

1.2 試藥 中藥菟絲子購于南昌益豐大藥房；對氯苯丙氨酸（PCPA）試劑盒購于Sigma有限公司；地西泮注射液購于江西省腫瘤醫院門診部；SOD、MDA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；IL-1β、TNF-α試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器 AdventurerTM電子天平（奧豪斯國際貿易有限公司）；微量進樣器（德國eppendorf公司）；TECAN 酶標儀sunrise（奧地利 TECAN公司）；TGL-16G型臺式高速離心機（上海市實驗儀器總廠）。

2 方法

2.1 制備菟絲子提取物［10］菟絲子1 000 g，8 000 mL水浸泡2 h，藥材微微膨脹，文火煎煮2次，每次0.5 h，合并2次煎煮液，并將其濃縮至0.4 g/mL，置于4 ℃冰箱，備用。

2.2 分組 60只SD大鼠隨機分為五組，分別為模型組、空白對照組、地西泮對照組（地西泮注射液0.9 mg/kg）、低劑量菟絲子提取物給藥組［菟絲子提取物150 mg/（kg·d）劑量組］、高劑量菟絲子提取物給藥組［菟絲子提取物350 mg/（kg·d）劑量組］，每組各12只。

2.3 建立對氯苯丙氨酸失眠大鼠模型 除空白對照組外，其他組都進行腹腔注射對氯苯丙氨酸混懸液（350 mg/kg），每天1次，時間持續3 d［11］。

2.4 給藥 建立模型后（即造模第四天），開始對不同組大鼠給藥。地西泮對照組的大鼠使用地西泮注射液（0.9 mg/kg）灌胃［12］，給藥組選擇不同濃度的菟絲子對大鼠進行灌胃，而空白對照組與模型組則都用相同體積的生理鹽水對實驗大鼠灌胃，每天1次，連續灌胃14 d。

2.5 大鼠血清的制備 最后一次灌胃后，第二天對大鼠進行腹腔注射5 %的戊巴比妥鈉（60 mg/kg），將其麻醉。大鼠被麻醉后立刻開腹，選擇鈍性分離將大鼠體內的臟器分開，腹主動脈取血［13］。置于離心機中進行低溫離心，轉速為5 000轉/min，15 min后，取出，去除沉淀，取上清液將其放置于20 ℃的冰箱。

2.6 血清中IL-1β和TNF-α的測定 放射免疫法測定大鼠血清中IL-1β和TNF-α 的含量進行測定［14］。即在抗原或抗體上利用放射性同位素標記，將其與被測的抗體或者抗原相互結合，形成抗原與抗體相互結合的復合物，利用儀器對形成的抗原抗體復合物來進行分析，并測定其含量。

2.7 血清中SOD活性及MDA含量的測定 按試劑盒的操作進行測定。

2.8 實驗數據統計與處理 實驗結果使用統計分析軟件SPSS 24.0進行處理，得到的結果用（±s）表示，通過多重比較法分析數據并且對每組的數據進行組間相互比較。當P<0.05時具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般情況 造模前所有大鼠情況正常，飲食健康，睡眠穩定。腹腔注射PCPA兩天后，除空白對照組，所有大鼠都呈現失眠狀態，晝夜活動紊亂，飲食規律不正常。灌胃一周后，地西泮對照組與高劑量菟絲子給藥組的大鼠狀況都十分接近正常組，而低劑量給藥組的大鼠狀況與模型組的差異較大，較為接近空白對照組。從大鼠健康狀況可知，菟絲子提取物可較為有效的改善失眠，且高劑量的療效比低劑量的療效好。

3.2 菟絲子提取物對失眠大鼠血清中的IL-1β、TNF-α含量的影響 實驗結果表明，與空白組比較，模型組大鼠IL-1β、TNF-α的含量都顯著降低。而與模型組比較，地西泮對照組、低劑量組、高劑量組的大鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量都顯著增加，其中地西泮對照組和高劑量組的IL-1β、TNF-α含量與空白對照組十分相近。見表1。

表1 菟絲子提取物對失眠大鼠血清中的IL-1β、TNF-α水平的影響（±s，n=12） ng/L

表1 菟絲子提取物對失眠大鼠血清中的IL-1β、TNF-α水平的影響（±s，n=12） ng/L

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 IL-1β TNF-α空白對照組 66.88±8.62 41.48±10.08模型組 36.42±13.12** 20.49±12.42**地西泮對照組 56.02±14.81# 36.58±9.47##低劑量組 39.43±12.13# 28.11±13.38#高劑量組 51.02±13.88## 33.02±9.36##

3.3 菟絲子提取物對失眠大鼠血清中SOD活性、MDA含量的影響 實驗結果表明，與空白組比較，模型組大鼠血清中SOD活性顯著減少，而MDA含量升高。與模型組比較，地西泮對照組、低劑量組、高劑量組的大鼠血清中SOD的活性都顯著增加，MDA的含量下降。其中地西泮對照組與高劑量組的SOD活性和MDA含量均接近空白對照組。見表2。

表2 菟絲子提取物對失眠大鼠血清中SOD活性、MDA含量的影響（±s，n=12）

表2 菟絲子提取物對失眠大鼠血清中SOD活性、MDA含量的影響（±s，n=12）

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別 SOD/U·mL-1 MDA/nmol·mL-1空白對照組 84.86±9.09 3.75±0.32模型組 63.05±10.19* 5.15±1.24**地西泮對照組 79.60±7.35# 3.13±1.14##低劑量組 69.59±6.28# 4.04±0.66#高劑量組 74.39±13.34# 3.08±0.31##

4 討論

采用PCPA建立失眠大鼠模型，消耗的時間比其他造模短，需要的費用也比較便宜,而且這種造?？芍貜托詮?，因此，一般都是用這種方法造失眠模型［15］。失眠使機體免疫力下降，免疫系統紊亂，免疫功能失調。而機體免疫能力又和細胞因子如IL-1β、TNF-α有密切的關系。研究表明TNF-α與睡眠調節密切相關，這兩者之間能相互調節，這樣就可以令機體的睡眠保持在穩定的狀態［16］。同時，IL-1β與睡眠有關的，IL-1β水平增加可促進睡眠，而抑制IL-1β則阻止睡眠［17］。本實驗模型組IL-1β、TNF-α的含量都低于正常水平，而使用了不同濃度的菟絲子提取物灌胃后血清中IL-1β、TNF-α的含量與模型組相比都有明顯升高，高劑量組的這兩種細胞因子水平接近陽性對照組，說明菟絲子提取物對大鼠血清中的IL-1β與TNF-α有促進作用。

失眠令大鼠消耗的能量增加、 抗氧化應激的能力減弱［18］。失眠使機體在夜間興奮，無法入睡，從而導致機體能量消耗增多，而能量產生的過程中往往是伴隨著活性氧的生成，能量消耗增加，活性氧含量就不斷增加，當產生的活性氧超過機體的抗氧化能力，大鼠體內就會發生使機體受到損害的氧化應激反應。大鼠體內一旦發生這個反應，將產生大量的有害氧化中間產物。丙二醛是機體內的脂質發生過氧化反應得到的物質,這使得生命大分子物質發生交聯聚合，而且它還具有使細胞死亡的毒性［19］。為了對抗機體產生損害的反應，機體擁有兩個抗氧化系統，其中一個是酶抗氧化系統，另一個則是非酶抗氧化系統。SOD是機體中一種能起到比較重要作用的抗氧化酶，它經常被機體用來去除體內多余的超氧陰離子自由基［19］，是酶抗氧化系統中比較重要的一種酶。實驗表明失眠大鼠血清SOD活性明顯降低且MDA含量明顯升高［20］，可能是失眠大鼠氧自由基大量產生，從而使得SOD的活性下降，導致了體內的氧自由基不斷增多,這些氧自由基攻擊大鼠體內的多不飽和脂肪酸，從而使大鼠體內的脂質發生過氧化反應，產生MDA等物質，引起細胞毒性，使細胞死亡［5］。本研究中，與空白對照組相比，模型組SOD活性明顯降低，MDA含量升高，說明失眠大鼠體內正是由于上述原因而發生了氧化應激反應；而與模型組相比，低、高劑量給藥組SOD活性都增加，MDA的含量都減少，說明中藥菟絲子提取物具有抗氧化的作用，從而改善了失眠的癥狀。

本實驗結果表明，菟絲子提取物可以提高血清中細胞因子IL-1β與TNF-α的含量，使血清中SOD活性得到提升，降低MDA的含量，從而改善了失眠大鼠的癥狀。因此，從菟絲子提取物提高失眠大鼠的免疫能力和抗氧化作用的能力來看，其對失眠有一定的治愈效果，本實驗為菟絲子治療失眠的臨床應用提供科學理論依據。