載順鉑的磁性納米藥物體系的制備及其抗肺癌活性研究

★ 姚雪蓮 嚴志宏 王一帆 彭珊珊 蔡瑛 向汝群 范嘉華（.江西中醫藥大學 南昌 330004；.江西省醫學科學院 南昌 330006）

順鉑是一種重要的癌癥化療藥物，廣泛用于卵巢癌、宮頸癌、頭頸癌及非小細胞肺癌的治療［1］。但其全身毒性是治療成功的主要障礙，受到包括腎毒性、嘔吐和神經毒性在內的副作用的限制［2］。如何提高腫瘤病灶內的藥物濃度以抑制腫瘤細胞生長，減少抗腫瘤藥物的用量以減輕全身毒副反應，是目前腫瘤化學藥物治療中亟待解決的問題。

磁性藥物載體具有磁靶向性，可使藥物精準地輸送到病灶部位，降低了藥物的系統毒性，從而減少對正常細胞的毒性，提高腫瘤局部的藥物濃度［3］。本研究擬采用共沉淀法制備Fe3O4MNPs，再進行包硅和氨基功能化，在此基礎上裝載抗腫瘤藥物順鉑。以小鼠肺癌腫瘤細胞為研究對象，考察載順鉑的磁納米藥物體系對小鼠肺癌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、異丙醇、濃氨水、乙醇均為分析純，均購自西隴科學股份有限公司；水合肼，分析純，購自國藥集團；硅酸四乙酯（TEOS，99 %）、3-氨丙基三乙氨基硅烷（APTES，99 %）、溴化鉀、三乙胺、二甲基亞砜（DMSO）均購自羅恩試劑；丙酮，分析純，購自天津市永大化學試劑開發中心；自制去離子水和蒸餾水；小鼠肺癌LLC細胞（CL-0140 Procell），購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。

真空干燥箱（DZF-6020，寧國沙鷹科學儀器有限公司）；電子分析天平（BS-214，北京賽多利斯儀器）；恒溫磁力攪拌器（85-2，上海司樂儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（HH-2，國華（常州）儀器制造有限公司）；超聲清洗儀（CSA-06BT，寧國沙鷹科學儀器有限公司）；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet IS5型，美國Thermo公司）；掃描電子顯微鏡（FEI Quanta250，美國FEI公司），透射電子顯微鏡（HT7800，日立HITACHI）；紫外可見分光光度計（UV-I600PC，上海美譜達儀器有限公司）。CCK-8法細胞增殖檢測試劑盒（KGA317，江蘇凱基生物）；Annexin V-APC/7-AAD apoptosis kit（AP105-100kit，MULTI SCIENCES 聯科生物）；全自動酶標（WD-2102B，北京六一生物科技）；NovoCyte?流式細胞儀（NovoCyte 2060R，艾森生物<杭州>有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 磁性納米顆粒Fe3O4的制備稱取10.9 g FeSO4·7H2O和4.0 g FeCl3·6H2O 溶解于30 mL去離子水中，通入氮氣，在機械攪拌器的攪拌下，加入2 mL水合肼，再逐滴加入35 mL濃氨水，調節溶液pH為9。攪拌30 min后，將反應體系升溫至80 ℃老化1 h，停止反應，用磁鐵進行磁性分離，棄去上清液，用去離子水洗滌下層固體，再用無水乙醇洗滌，最后在真空干燥器中60 ℃干燥12 h，即得Fe3O4納米顆粒。

1.2.2 包硅磁納米顆粒（Fe3O4@SiO2）的制備取1 g上述制備的磁性Fe3O4納米粒子分散于裝有100mL異丙醇和8 mL去離子水的三頸燒瓶中，超聲15 min后，緩慢滴加10 mL濃氨水調節pH 8。再加入8 mL TEOS，45 ℃下快速攪拌，反應12 h。反應結束后磁場分離出磁流體，分別用去離子水和無水乙醇反復洗滌。最后在真空干燥器中60 ℃干燥12 h，即得Fe3O4@SiO2納米粒子。

1.2.3 包氨磁納米顆粒（Fe3O4@SiO2-APTES）的制備取上述制得的Fe3O4@SiO2粒子6 g分散于80 mL無水乙醇，加入12 mL APTES，2 mL三乙胺，快速攪拌24 h，產物用去離子水和無水乙醇洗滌，洗滌后置于60 ℃真空干燥，即得Fe3O4@SiO2-APTES的棕褐色粉末。

1.2.4 載順鉑磁納米藥物體系的制備分別稱取2 mg順鉑和20 mg Fe3O4@SiO2-APTES磁納米粒子，共分散于5 mL丙酮中，60 ℃攪拌1 h，在外加磁場作用下得到產物，用去離子水反復洗滌后，置于真空干燥箱中干燥。

1.2.5 載順鉑磁納米體系特征檢測將真空干燥后的載順鉑納米粒子與 KBr研磨混合并壓片制得透明薄片，采用傅里葉變換紅外光譜儀,分辨率4 cm-1，掃描次數70，掃描范圍400～4 000 cm-1。將真空干燥的載順鉑納米粒子置于電鏡樣品臺上，分別采用掃描電鏡和透射電鏡觀察其形貌、粒徑。

1.2.6 載順鉑磁納米體系的載藥量及包封率的測定取載順鉑磁納米粒子分散于DMSO中，離心，取上層清液2 mL，紫外分光光度計測定其在305nm波長下的吸光度值，繪制標準曲線計算出殘液中順鉑藥物的含量。按照公式計算其載藥量和包封率并對比。載藥量（%）=（順鉑總量-順鉑殘余量）/載藥納米粒子總量×100 %；包封率=（順鉑總量-順鉑殘余量）/順鉑總量×100 %［4］。

1.2.7 載順鉑磁納米體系的體外藥物釋放將40 mg載順鉑磁納米顆粒分散于8 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）后轉移到透析袋（分子截留量300.5）中，加入9倍體積PBS釋放介質，并在37℃的恒溫水浴中以100 r/min振蕩, 分別于不同時刻取出2mL釋放介質作為樣品, 并加入等量新鮮介質,測定其在 305 nm下的吸光度值，取3次實驗平均值，根據標準曲線計算出順鉑的累積釋放量。

1.2.8 CCK8檢測磁性納米載體的細胞毒性培養LLC細胞系，接種于96孔板中（7×103個/孔）培養24 h，加入不同濃度的（6.25，12.5，25，50，100 μg/mL）載藥磁納米粒子，繼續培養24 h后，將處理后的細胞每組換成相同培養基100 μL，每孔加入10 μL CCK8試劑，置于培養箱中孵育2 h；酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光值。檢測細胞的存活率，看各濃度下細胞的存活率，計算IC50值。

1.2.9 細胞凋亡檢測LLC細胞以5×105/mL細胞懸液孔接種于6孔板內，培養至狀態良好后造模組加入含有載藥磁納米粒子的培養液（75.36 μg/mL），培養24 h后胰酶消化收集所有細胞，PBS洗兩遍，加500 μL預冷的1×Binding Buffe，每管各加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-AAD輕微混勻后，室溫避光孵育10 min上流式儀檢測。

1.3 統計學方法 應用SPSS 20.0軟件進行統計分析。所有實驗重復3次，定量結果采用均數±標準差（±s）表示。兩組之間定量數值比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間定量數值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K法。檢驗標準α=0.05。

2 結果

2.1 磁納米藥物載體的物理表征 磁納米藥物載體的紅外光譜圖見圖1?？梢?，585 cm-1為Fe-O鍵伸縮振動所產生的峰，即Fe3O4的特征峰；1 090 cm-1為Si-O-Si所產生的特征峰；2 990 cm-1處的特征峰對應了-CH2-中碳氫鍵的不對稱伸縮振動產生的峰；3 444 cm-1為-NH2中N-H的伸縮振動所產生的峰。

圖1 紅外光譜圖

磁納米粒子的電鏡圖見圖2。圖2（a）是Fe3O4粒子，可見其粒子外觀呈球形，平均粒徑約為10 nm；圖2（b）是載順鉑的Fe3O4@SiO2-APTES納米粒子，可見其粒子為球形，平均粒徑為250 nm，分散良好。

圖2 Fe3O4粒子的透射電鏡圖（a）和載順鉑磁納米藥物的掃描電鏡圖（b）

磁納米藥物載體的磁性表征的VSM圖見圖3。由圖可知其磁飽和值分別為0.390 5 emu/mg，這個結果表明，該磁納米藥物體系有較好的磁響應能力，在外加磁場作用下能夠快速有效地與基質分離，有較好的磁靶向性。

圖3 磁納米藥物載體的VSM圖

2.2 載藥量及包封率測定 經紫外分光光度計測定，以順鉑濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制線性回歸曲線，得線性方程Y=0.360 5X-0.487 3（R2=0.9833）。根據載藥率及包封率公式可以確定載藥量，得出順鉑載藥率為6.18 %，包封率為60.12 %。

2.3 載順鉑磁納米體系的體外藥物釋放 載順鉑磁納米體系的體外藥物釋放率見圖4。從圖中可見，該磁納米粒子在1 h內迅速釋放所載順鉑總量的50 %，剩余的順鉑在24 h內從納米粒中緩慢釋放達到89 %。

圖4 累積藥物釋放率

2.4 CCK8檢測結果 與正常組相比，加入不同濃度的載藥磁納米粒子作用細胞后細胞的存活率下降，且隨著作用濃度的增加，細胞的存活率下降（P<0.05），半抑制濃度為75.36 μg/mL。見圖5。

圖5 細胞CCK8檢測及IC50結果

2.5 流式檢測結果 與空白組相比，加入載藥磁納米粒子作用細胞后，細胞的凋亡率顯著增大（P<0.05）。見圖6。

圖6 流式檢測凋亡結果

3 結論

本文制備了以Fe3O4為核心的磁納米粒子，并進行包硅、氨基功能化修飾，然后裝載抗腫瘤藥物順鉑，并研究了納米載藥體系對化療藥物順鉑的運載率及納米載藥體系對小鼠肺癌細胞的凋亡情況。結果表明所設計的體系具有較高的生物相容性、良好的磁靶向性和體外抗肺癌活性，為進一步的體內治療提供了實驗依據。