酶解河蟹邊角料制備調味汁的加工工藝研究

朱亞軍，吳浩然，林 琳，姜紹通，陸劍鋒*

（合肥工業大學食品與生物工程學院安徽省農產品精深加工重點實驗室農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009）

河蟹學名中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），是我國淡水養殖中重要的經濟蟹類之一[1]。因其滋味佳、高營養而深受消費者喜愛[2]。近年來，河蟹養殖業快速發展，2019年其養殖產量為77.87萬t，相比于2018年增加2.88%[3]。目前我國河蟹的食用方式主要為蒸煮，但其作為一種季節性的水產品且難以長期保持鮮活，不能均衡供應市場[4]。加工體系不完善，產品種類單一等問題，嚴重影響了河蟹的綜合利用和經濟效益[5]。

近年來，部分河蟹被制作成醉蟹、蟹粉（蟹肉）、鹽漬蟹、醬漬蟹等深加工制品，銷售于生產淡季，延長了河蟹的上市期并且能保持較好的肉質和蟹獨特的風味[6]。但隨之而來的河蟹加工下腳料和邊角料的利用問題也亟待解決，據報道[7]，蟹類下腳料中仍含有豐富的蛋白質，是優良的食物資源。

蟹類分割加工過程中產生的蟹殼、蟹腳和內臟等通常稱為下腳料，而邊角料則是包括碎蟹肉、碎蟹黃、碎骨和骨筋等殘渣[8]。蟹類作為名貴的水產品，其邊角料中仍含有多種營養成分，之前的研究發現，河蟹邊角料中蛋白質、脂肪和礦物質含量豐富，含有大量不飽和脂肪酸和必需脂肪酸，且必需氨基酸種類滿足人體營養需求，營養價值很高；其中鮮味氨基酸占氨基酸總量的36%左右，是制作調味料的良好原料[9]。目前，有相關研究人員利用梭子蟹類下腳料制備抗氧化肽[10]，以梭子蟹下腳料為原料，利用酶法制備蛋白水解物[11]，采用溶劑法提取梭子蟹下腳料中的蟹油[12]或將蝦蟹下腳料加工成海鮮調味制品[13]等。TREMBLAY A等[14]設計膜工藝濃縮雪蟹烹飪的廢水，發現其可以轉化為食品工業的天然香氣。梁攀[15]將盤錦河蟹的蟹殼干燥后粉碎，采用發酵法結合酶法從蟹殼粉中制備甲殼素。阿拉姆[16]以蟹殼為原料制備殼聚糖，可以用于吸附溶液中的重金屬離子。江晨浩等[17]對廢棄蟹殼進行活化和碳化處理，采用共沉淀的方法將Fe3O4附載到蟹殼炭上，所制備磁性蟹殼活性炭具有高吸附能力，可實現快速磁分離。但有關蟹類邊角料的加工利用研究較少，尤其是我國產量日益增加的淡水河蟹。

本文以河蟹分割加工后的邊角料為原料，采用酶法水解制備美拉德反應液，并在此基礎上研究河蟹調味汁的制備工藝，以期為河蟹邊角料的有效加工利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河蟹加工邊角料：明光市永言水產食品有限公司；5'肌苷酸二鈉＋5'鳥苷酸二鈉（I+G）、料酒、味精、鹽、白糖、卡拉膠、淀粉和焦糖色：合肥家樂福超市。

鹽酸、濃硫酸、甲醛、氫氧化鈉、硼酸、木糖、堿性蛋白酶（2.0×104U/g）：國藥集團化學試劑北京有限公司；試驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA1104N電子分析天平：上海民橋精密科學儀器有限公司；PHS-3C型精密酸度計：上海虹益儀器儀表有限公司；HZ-2兩孔數顯水浴鍋：江蘇金壇市環宇科學儀器廠；RZ-5286A旋轉蒸發儀：鞏義市予華儀器有限責任公司；T18高速分散器：德國IKA公司；CT15RT臺式高速冷凍離心機：上海天美生化儀器設備工程有限公司；ICAP-7400電感耦合等離子發射光譜儀：美國賽默飛世爾科技公司；DHG-9123J精密恒溫鼓風干燥箱：上海三發科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

河蟹加工邊角料運輸時加冰塊保溫，并置于-18 ℃冷凍儲存備用。

1.3.2 河蟹調味料制備工藝流程與操作要點

操作要點：

酶解：取一定量河蟹邊角料，按比例加入蒸餾水，混合后用高速分散器均質勻漿后置于恒溫水浴鍋中，待溫度達到堿性蛋白酶最適溫度，加入酶并充分攪拌使混合均勻，將溶液的pH值調至蛋白酶的最適pH值。在酶的最適反應條件下反應4 h，酶解后將反應液在溫度100 ℃條件下進行滅酶15 min，滅酶后冷卻至室溫，6 000 r/min離心15 min，得到上清液為酶解液。

調味料基液的制備：根據前期的預實驗，將4%木糖加入上述酶解工藝得到的酶解液中，在115 ℃下進行美拉德反應1 h，以提高風味，從而得到制備河蟹調味料的基液。

調味和殺菌：在90 ℃恒溫水浴中進行河蟹調味汁的調味和殺菌，取100 mL美拉德反應液，加入白砂糖、鹽、料酒、味精、I+G、淀粉、卡拉膠、焦糖色素，攪拌均勻后蓋上瓶蓋，使輔料均勻溶解在基液中，然后于90 ℃繼續水浴加熱30 min進行巴氏滅菌，即得河蟹調味料。

1.3.3 酶解條件工藝優化

（1）酶解條件優化單因素試驗

在預試驗的基礎上，以水解度為評價指標，選擇蛋白酶添加量（200 U/g、400 U/g、600 U/g、800 U/g、1 000 U/g、1 200 U/g）、酶解液pH值（7、8、9、10、11、12）、料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）（g∶mL）、酶解時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）和酶解溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）5個因素進行單因素試驗。優化單個因素時，其他4個酶解條件均取第三水平（即蛋白酶添加量600 U/g，酶解液pH值9，料液比1∶3，酶解時間3 h，酶解溫度50 ℃）。

（2）酶解工藝優化正交試驗

正交試驗設計參考單因素試驗結果，選擇堿性蛋白酶添加量、溫度、pH值、料液比為評價因素進行4因素3水平的L43正交試驗，因素與水平如表1所示。

表1 酶解工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzymolysis process optimization

1.3.4 配方工藝優化

（1）配方優化單因素試驗

在預試驗的基礎上，以調味汁的感官評分為評價指標，在添加0.05%的I+G、0.2%的卡拉膠以及0.1%的焦糖色的相同條件下，選擇白砂糖（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、味精（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、鹽（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、淀粉（1%、2%、3%、4%、5%、6%）和料酒（1%、2%、3%、4%、5%、6%）添加量5個因素進行單因素試驗，優化單一因素時其余4個酶解條件均取第三水平（即糖6%，味精6%，鹽6%，淀粉3%，料酒3%）。

（2）配方優化正交試驗

根據單因素試驗結果分析，選取白砂糖添加量、味精添加量、食鹽添加量和淀粉添加量進行4因素3水平的L43正交試驗，因素與水平見表2。

表2 調味汁配方優化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for sauce formula optimization

1.3.5 水解度測定方法

水解度按BLANQUET S等[18]的方法測定，水解度表示為酶解后溶液中氨基酸態氮含量和酶解前溶液中氨基酸態氮含量之比。

1.3.6 感官評定方法

根據畢軍華等[19]所述方法進行感官評價，對河蟹調味汁的品質及食用效果進行評價。評價小組的組成為5名固定人員，小組成員皆經過感官評價培訓后具有一定評價經驗。各項目按比重確定最后得分，產品的最終得分為評價小組的平均得分，河蟹調味汁的感官評分標準如表3所示。

表3 河蟹調味汁感官評定標準Table 3 Sensory evaluation standards of crab sauce

1.3.7 理化及衛生指標測定

（1）總氮量

按GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定。

（2）氨基酸態氮含量

按GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》的方法。

（3）污染物含量

稱取干燥樣品0.2 g，用體積比為5∶2的HNO3/HClO4消解樣品至溶液呈無色，隨后加入蒸餾水定容至10 mL。采用原子吸收光譜法和火焰原子吸收光譜法測定樣品溶液中鉻、無機砷和鉛的含量。

（4）微生物指標

測定菌落總數、大腸桿菌數、沙門氏菌數和金黃色葡萄球菌數分別采用GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》、GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》、GB4789.4—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》、GB 4789.10—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》中描述的方法進行。

1.3.8 揮發性風味物質測定

揮發性風味物質檢測采用頂空固相微萃取技術，根據葛孟甜等[20]的方法進行測定，通過將氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析檢測到的揮發性化合物與美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）11和Wiley 7.0的MS庫的參考質譜進行比較（匹配度高于80%），對其揮發性成分進行鑒定。

1.3.9 數據分析

使用Excel 2016軟件進行數據分析，數據結果表示為“平均值±標準差”。

2 結果與分析

2.1 酶解條件優化單因素試驗結果與分析

2.1.1 酶添加量對河蟹邊角料水解度的影響

由圖1可知，河蟹邊角料的水解度隨著添加堿性蛋白酶量的增加而增加，酶的添加量為600 U/g時，水解度達到最高（26.47%），當堿性蛋白酶的添加量繼續增加時，水解度的變化逐漸減緩。由米氏方程可知，當底物濃度較高時，酶被底物所飽和，隨著蛋白酶量的增加，底物的相對濃度降低，更多的酶與底物結合，產生更多的酶促反應產物，因此水解度提高。當酶量繼續增加，而底物濃度恒定，沒有更多的底物與酶結合進行反應，水解度逐漸不再明顯變化[21]。因此堿性蛋白酶的最佳添加量為600 U/g河蟹邊角料。

圖1 酶添加量對河蟹邊角料水解度的影響Fig. 1 Effect of protease addition on hydrolysis degree of crab scraps

2.1.2 酶解液pH值對河蟹邊角料水解度的影響

由圖2可知，當pH在7～10時，河蟹邊角料的水解度隨酶解液pH值的升高而增加，pH=10時水解度達到最大（24.41%）。隨著pH值的繼續增大，水解度呈降低的趨勢。這是因為堿性蛋白酶的空間結構會被堿性過高的酶解液破壞，酶的活性從而降低[22]。因此酶解液的最適pH值為10。

圖2 pH值對河蟹邊角料水解度的影響Fig. 2 Effect of pH on hydrolysis degree of crab scraps

2.1.3 料液比對河蟹邊角料水解度的影響

由圖3可知，河蟹邊角料的水解度隨著料液比增加先增大后減小，料液比為1∶4（g∶mL）時水解度最大。料液比較小時導致酶解液體系的黏稠度增大，酶制劑和酶解產物不易擴散；料液比較高時底物濃度低，酶和底物作用小，蛋白質不能被完全酶解[23]。由此確定，河蟹邊角料和酶解液的最佳比例為1∶4（g∶mL）。

圖3 料液比對河蟹邊角料水解度的影響Fig. 3 Effect of solid and liquid ratio on hydrolysis degree of crab scraps

2.1.4 酶解時間對河蟹邊角料水解度的影響

由圖4可知，在0～4 h內，河蟹邊角料酶解液的水解度隨著酶解時間的增加而增大，酶解時間在4 h后，水解度變化不大。時間過短導致酶解不充分，隨反應時間的增加，反應液中的蛋白質逐漸與酶反應產生酶解產物，因此水解度增加，酶解時間大于4 h后，一方面底物或許已經被完全水解，另一方面時間過長可能導致酶的部分失活，水解度的變化趨勢逐漸平緩[24]。因此，最佳的酶解時間為4 h。

圖4 酶解時間對河蟹邊角料水解度的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree of crab scraps

2.1.5 酶解溫度對河蟹邊角料水解度的影響

由圖5可知，河蟹邊角料的水解度隨著酶解溫度的升高先增加后降低，水解度在50 ℃時達到峰值。這主要是由于酶的活性隨著酶解溫度的升高逐漸增強，隨之加快了酶促反應，水解程度增加。當溫度超過酶的最適溫度后，酶分子結構中的次級鍵受到破壞而解體，酶的活性因酶蛋白發生變性而減弱，酶解反應速率下降，水解度降低[25]。由此確定50 ℃為酶解反應的最適溫度。

圖5 酶解溫度對河蟹邊角料水解度的影響Fig. 5 Effect of enzymolysis temperature on hydrolysis degree of crab scraps

2.2 河蟹邊角料的酶解條件優化正交試驗結果與分析

以堿性蛋白酶添加量（A）、溫度（B）、pH值（C）和料液比（D）為評價因素，以水解度為評價指標，進行4因素3水平正交試驗，優化酶解條件，試驗結果與分析見表4，方差分析見表5。

由表4和表5可知，不同因素對酶解效果的影響程度為：酶添加量＞酶解液pH值＞料液比＞酶解溫度。堿性蛋白酶添加量對結果影響極顯著（P＜0.01），pH值對結果影響顯著（P＜0.05），直觀結果表明酶解的最佳條件組合為A3B1C3D2，極差分析得到酶解條件最佳組合為A3B1C1D2，A3B1C1D2條件下測得的水解度24.09%，比A3B1C3D2條件下的23.73%略高。因此A3B1C1D2是最佳的酶解條件組合，即料液比1∶4（g∶mL），添加650 U/g堿性蛋白酶，酶解溫度45 ℃，酶解pH=10.5，酶解時間4 h。

表4 河蟹邊角料的酶解條件優化正交試驗結果及分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for hydrolysis conditions optimization of crab scraps

表5 正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.3 調味汁配方優化

2.3.1 采用美拉德反應增香制備調味汁原液

按照正交試驗所得最優酶解條件組合得到酶解液，根據前期實驗結果，取4%的木糖與酶解液混合均勻，置于115 ℃溫度下進行美拉德反應，1 h后將反應增香后的調味汁的調配原液保存待用。在此條件下得到的美拉德反應液中含有氨基酸態氮0.532 g/100 mL。

2.3.2 調味汁配方優化單因素試驗結果與分析

根據上述酶解條件優化后得到河蟹邊角料的美拉德反應液，在相同體積的美拉德反應液中分別添加一定量的糖、味精、鹽、淀粉和料酒，將調味汁應用于涼拌菜和清炒菜中（調味汁和菜的比例約為1∶4），分析糖、味精、鹽、淀粉和料酒對調味汁感官評分的影響，結果見圖6。

圖6 調味汁配方優化單因素試驗結果Fig. 6 Single factor experiments results for formula optimziation of sauce

由圖6A可知，河蟹調味汁感官評分隨著糖的增加先增加后下降，白砂糖的添加量為8%時，感官評分達到峰值。這是由于少量糖的加入對提高蟹味調味汁的口感和顏色有很大幫助[26]，但調味汁的白砂糖添加過量導致產品甜度太高而影響了食用體驗。由圖6B可知，隨著味精的添加，河蟹調味汁的感官評分的變化趨勢為先上升后降低，但總體變化不大，當味精添加至6%時感官評分相對較高。由圖6C可知，評分隨食鹽量的增加呈先升后降的趨勢，當食鹽的用量為6%時評分達到峰值。鹽對調味汁的影響主要在口感滋味，產品中加入適量的鹽可以改善河蟹調味汁的口感，而當加入過量的鹽時，調味汁的咸甜平衡遭到破壞，感官品質下降。由圖6D可知，調味汁的評分隨淀粉量的增加先增后降，且下降幅度較大，感官評分達到峰值時的淀粉添加量為2%～3%。淀粉對河蟹調味汁的影響主要在產品的粘稠度方面[27]，適量的淀粉可以增加調味汁的粘稠口感，提高食用者的感官體驗，而過多的添加淀粉會導致調味汁黏稠度過高而影響產品的品質。由圖6E可知，河蟹調味汁的感官評分受料酒的影響較小，隨著料酒的添加，感官評分變化趨勢為先上升后下降，在添加3%的料酒時達到峰值。由結果可見，最佳的調味汁配方為糖添加量8%、味精6%、食鹽6%、淀粉2%、料酒3%。

2.4 調味汁配方優化正交試驗結果與分析

以白砂糖（A）、味精（B）、食鹽（C）和淀粉（D）添加量為評價因素，以感官評分為評價指標，進行4因素3水平正交試驗，優化河蟹調味汁配方，試驗結果與分析見表6，方差分析見表7。

表6 河蟹調味汁正交試驗結果及分析Table 6 Results and analysis of orthogonal experiments of crab sauce

表7 調味汁配方優化正交試驗結果方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal experiments results of formula optimization of sauce

極差分析得到，調味汁調配效果受各因素的影響程度為：糖用量＞淀粉用量＞味精用量＞鹽用量，其中糖和淀粉的添加量對產品感官評分的影響極顯著（P＜0.01），味精添加量對產品感官有顯著影響（P＜0.05）。由表6可知，直接分析最優組合A1B3C3D3與計算分析的最優組合A1B3C2D3不完全一致，設計驗證試驗進一步確定配方的最佳組合方案。

驗證試驗可知，A1B3C3D3的感官評分（78.68分）略低于A1B3C2D3的感官評分（79.63分）。因此得出，A1B3C2D3為河蟹調味汁的最優配方，即在添加100 mL河蟹邊角料美拉德反應液（含氨基酸態氮0.532 g）的基礎上，按比例加入7%的糖、6%的鹽、2.5%的淀粉、7%的味精、2%的料酒。另外還需添加0.2%的卡拉膠、0.05%的I+G和0.1%的焦糖色。

2.5 揮發性風味物質測定

河蟹調味汁中的風味物質測定結果見表8。由表8可知，河蟹調味汁中檢測出10種醛類、8種酮類、4種醇類、4種酯類、3種酸類、2種呋喃類、2種吡嗪類和5種烴類揮發性風味化合物，共計38種。河蟹調味汁產品的揮發性風味物質主要是醛類、酮類和酯類化合物，這3類化合物的相對含量占比最高，分別為28.99%、16.21%和5.96%。醛類化合物是一種閾值很低，可以提供花香和油脂香的化合物[28]，可以為河蟹增加鮮香，它在河蟹的風味中占重要地位[29]。醇類是一種可以提供花果香及黃油香的化合物，但其閾值較高[30]，對河蟹調味汁的風味影響較小。酯類是一種非常重要的可提供花果香和奶油香的呈香化合物[31]，而且閾值很低。據檢測，河蟹調味汁中還存在有含量高達3.85%的乙酸乙基酯，此外，還檢測到如苯甲酸乙酯、2-氯苯乙酯和2-甲氧基-4-（2-丙烯基）-乙酸苯酯等酯類化合物，這些風味物質給河蟹調味汁帶來了濃濃的酯香風味。

表8 河蟹調味汁中的風味物質測定結果Table 8 Determination results of flavor compounds in crab sauce

續表

2.6 河蟹調味汁感官、理化及衛生指標

測定該河蟹調味汁產品的感官、理化及微生物指標，并參考GB 10133—2014《食品安全國家標準水產調味品》、DB35/T 900—2009《海鮮水解調味料》和NY/T 1710—2009《綠色食品水產調味品》中的指標進行對比，結果見表9。

由表9可知，本工藝制作的河蟹調味汁產品具有調味汁特有的色澤、形態和滋氣味，并且經檢測，該產品的理化指標和微生物指標在相關標準范圍內。

表9 河蟹調味汁感官、理化及衛生指標及國標控制標準Table 9 Organoleptic, physicochemical, hygienic indexes and national control standards of crab sauce

3 結論

該研究以河蟹分割加工后的邊角料為原料，在探究優化酶解邊角料工藝的基礎上，以酶解液為基液開發一款河蟹調味汁。根據單因素試驗結果，選擇料液比、加酶量、酶解溫度和pH四個主要影響因素進行正交試驗，正交試驗結果表明：在料液比1∶4（g∶mL）的河蟹邊角料反應液中添加650 U/g堿性蛋白酶，45 ℃，pH=10.5條件下，酶解4 h得到酶解液的水解度最佳，為24.09%。采用美拉德反應對酶解液進行增香，以100 mL美拉德反應液（含氨基酸態氮0.532 g）為基液，添加7%的味精、6%的鹽、7%的白砂糖、2.5%的淀粉、2%的料酒、0.2%的卡拉膠、0.05%的I+G和0.1%的焦糖色，得到口感最優的河蟹調味汁，其感官評分為79.63分。對所調配的河蟹調味汁中的揮發性風味物質進行檢測分析，根據初步建立的河蟹調味汁的感官、理化及微生物指標，本產品的各項指標均在相關標準范圍內。