脊尾白蝦對低氧響應的轉錄組學分析*

曹 梅 王興強 秦傳新 沈 曄 張子楊 錢詩悅

脊尾白蝦對低氧響應的轉錄組學分析*

曹 梅1王興強1①秦傳新2沈 曄1張子楊1錢詩悅1

(1. 江蘇海洋大學海洋科學與水產學院 連云港 222005; 2. 中國水產科學研究院南海水產研究所 廣東省漁業生態環境重點實驗室 廣州 510300)

本研究通過高通量測序，分析低氧脅迫下脊尾白蝦()某些基因的差異表達，獲得10.62 Gb高質量測序數據，組裝得到155113條轉錄本和118953條Unigene。注釋Unigene 37580條。其中，33659條Unigene與Nr蛋白數據庫基因同源；11275條Unigene注釋到KEGG數據庫，歸類到223個代謝通路。低氧脅迫產生1392條差異表達基因，包括311條上調基因和1081條下調基因，784條差異基因得到注釋，并富集到抗氧化活性、細胞連接、蛋白結合轉錄因子活性、多細胞生物過程、復制和生殖等過程，表明低氧脅迫激活了蝦體適應缺氧的一系列生理活動。其中，低氧脅迫下，低氧誘導因子1() 2個亞基和表達量上調；實時定量測定證實，在脅迫的后期，脊尾白蝦肝胰臟和鰓和明顯上調，推測脊尾白蝦細胞在低溶氧環境下誘導產生，刺激機體增加血液氧的供應能力。同時，低氧脅迫下，脊尾白蝦差異基因富集到糖酵解/葡萄糖生成、精氨酸和脯氨酸代謝和丙酮酸代謝等通路，表明蝦體缺氧使糖酵解等無氧代謝途徑增強，同時促進了部分糖類和氨基酸的代謝。另外，低氧脅迫下，脊尾白蝦溶酶體通路、吞噬通路、過氧化物酶體通路和內吞作用通路的差異基因較多，推測低氧誘導因子可能通過抑制線粒體生物合成和活化線粒體自噬來降低線粒體氧耗。

脊尾白蝦；低氧脅迫；轉錄組分析；差異基因表達

溶解氧是對蝦養殖環境中重要的環境因子，直接影響對蝦的存活、生長、代謝、消化和免疫能力。養殖環境中溶解氧受諸多因素的影響，環境中浮游植物優勢種群的突然改變或死亡、陰天暴雨及過量投餌造成的池塘水質污染等都會導致溶解氧急劇下降(鄭慧等, 2014; 李根瑞等, 2016)。此時，凡納濱對蝦()、日本沼蝦()、細角濱對蝦()和羅氏沼蝦()等抗氧化活性和免疫力發生顯著變化(Han, 2018)。低氧脅迫時，日本沼蝦有氧代謝減弱，無氧酵解和抗氧化能力增強，糖原和磷酸精氨酸大量消耗，以維持機體能量需要(Sun, 2018)。其中，低氧誘導因子1 ()是蝦體維持氧穩態的關鍵異二聚體轉錄因子，由受氧調節的α亞基和組成型表達的β亞基組成，最先由Semenza(1992)在缺氧誘導的細胞核抽提物中發現，參與許多重要的生物學反應。例如，和亞基均參與蝦類缺氧適應性反應(Terova, 2010; 連春盎, 2016)。缺氧時，凡納濱對蝦鰓、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和肝胰臟磷酸果糖激酶、果糖-1,6-二磷酸酶表達量顯著增高，而或亞基的沉默阻斷了鰓中己糖激酶表達和酶活性誘導(Camacho-Jiménez, 2018)。通常情況下，的穩定性和活性由決定，的調節受多種因素影響，且為專一受O2調控的亞基。的N末端用來介導α和β兩亞基二聚化及與靶基因特異DNA序列結合，的C末端用來介導降解和反式激活，含有2個獨立的反式激活結構域，2個結構域序列間為負調控反式激活結構域，而中部是氧依賴降解結構域(Oxygen dependent degradation domain, ODDD)，ODDD決定的穩定性。在常氧條件下，位于ODDD內的脯氨酸殘基的羥基化可促進HIF1α的泛素化和蛋白酶的降解，這種羥基化作用由多聚羥化酶介導。其中，脯氨酸羥化酶(PHDs)被認為在細胞質中廣泛表達，且在羥基化中作用最大。另一種羥基化酶是抑制劑，主要進行天門冬氨酰殘基的羥基化，進而抑制的激活(李國青等, 2005)。轉錄組學可用于分析不同組織或生理狀態下某些基因表達水平的差異，發掘與特定生理功能相關的未知基因。本研究通過高通量測序，分析低氧脅迫下脊尾白蝦()某些基因的差異表達，可為進一步揭示蝦體響應低氧脅迫的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

1.1.1 低氧脅迫實驗 實驗前，脊尾白蝦暫養1周，以適應實驗室環境。暫養期間，海水溫度為22℃~ 24℃、鹽度為29、pH為8.1，人工增氧。隨機挑選濕重為(3.15±0.26) g的脊尾白蝦60只，分為2組，每組3個重復，每個水族箱(水體約50 L)放養10只脊尾白蝦，人工增氧適應24 h，哈希(HACH) DR900測定實驗水體溶解氧濃度為7.6 mg/L。實驗開始時，停止低氧脅迫組的人工增氧，水族箱用2 mm厚液體石蠟封閉。脅迫約3.5 h后，脊尾白蝦蝦體從尾部開始變白；約4 h后，開始側臥游動，猜測其處于昏厥狀態，此時，水體溶解氧濃度為(1.13±0.26) mg/L，脊尾白蝦整體取樣，速凍于液氮中備用。預實驗表明，低氧脅迫條件下，白蝦側臥后約10~20 min死亡。為確保取到新鮮的樣品，白蝦側臥游動時馬上取樣。對照組保持人工增氧，白蝦游動正常，溶解氧濃度為(7.59±0.66) mg/L，同樣取樣凍存。

1.1.2 基因表達驗證實驗 實驗前，脊尾白蝦暫養1周，暫養條件同1.1.1。隨機挑選濕重為(2.77±0.34) g的脊尾白蝦120只，分為2組，每組設3個重復，每個水族箱(水體約為100 L)放養20只白蝦，人工增氧適應24 h，哈希(HACH) DR900測得水體溶解氧濃度為7.6 mg/L。實驗開始時，低氧脅迫組停止人工增氧，水族箱用2 mm厚液體石蠟封閉，在0、10、20、40、120、240和480 min，從每個箱中取2只蝦，解剖取出肌肉、鰓和肝胰臟，液氮速凍，取樣時間點水體溶解氧濃度分別為(8.05±0.40)、(7.21±0.23)、(6.71± 0.18)、(6.10±0.22)、(5.81±0.25)、(4.08±0.47)和(2.03± 0.15) mg/L；對照組保持人工增氧，白蝦游動正常，溶解氧濃度為(8.11±0.42) mg/L，同樣取樣凍存。

1.2 轉錄組測序

將1.1.1中凍存的低氧脅迫組和對照組樣品分別在液氮中全蝦研磨混合，常規方法提取總RNA。采用帶有Oligo (dT)的磁珠富集真核生物mRNA，加入破碎液，將mRNA進行隨機打斷，以mRNA為模板，反轉合成雙鏈cDNA鏈。利用AMPure XP beads純化cDNA，對純化的雙鏈cDNA進行末端修復、加尾并連接測序接頭，然后，采用AMPure XP beads進行片段大小選擇。最后，通過PCR富集得到cDNA文庫。送北京百邁客生物科技有限公司進行HiSeq2500高通量測序，測序讀長為PE125。

1.3 生物信息學分析

對原始數據進行過濾，去除其中的接頭及低質量Reads，獲得高質量的測序數據。將高質量測序數據通過Trinity軟件進行序列組裝，獲得該物種的Unigene庫。將低氧脅迫組和對照組高質量的測序數據與組裝得到的Unigene庫進行序列比對和基因表達量分析，篩選差異表達的基因。使用BLAST軟件將Unigene序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG和KEGG數據庫比對，獲得Unigene及差異表達基因的功能注釋信息。使用TransDecoder軟件進行Unigene基因結構預測。

1.4 實時定量測定

常規方法提取1.1.2中的樣品RNA，反轉錄成cDNA。同時，設計引物進行實時定量PCR，引物序列見表1；利用軟件SPSS 11進行統計分析，以<0.05作為差異顯著水平。

表1 脊尾白蝦實時定量所用引物序列

Tab.1 Sequences of P. carincauda qRT-PCR primers

2 結果

2.1 轉錄組測序數據組裝

完成對照和低氧脅迫組脊尾白蝦樣品的轉錄組測序，獲得10.62 Gb高質量測序數據，各樣品高質量測序數據均達到5.27 Gb，質量值≥30的堿基所占的百分比(Q30)≥90.21%(表2)。

應用Trinity對高質量測序數據進行組裝，得到155113條轉錄本和118953條Unigene，轉錄本與Unigene的N50分別為1940和928 (表2)。序列長度為200~300 nt的Unigene最多，占總數的42.76%；300~500 nt的有33316條，占28.01%；500~1000 nt有19088條，占16.05%；1000~2000 nt有9112條，占7.66%；2000 nt以上的Unigene有6569條，占5.52%。

表2 高質量測序數據評估統計

Tab.2 Statistics for evaluation of clean sequencing data

注：Q30：質量值≥30的堿基所占的百分比

Note: Q30: Percentage of bases quality score which is greater than or equal to 30

表3 組裝結果統計

Tab.3 Statistics of assembly results

2.2 Unigene功能注釋

對脊尾白蝦Unigene進行功能注釋，選擇BLAST參數≤10–5和HMMER參數≤10–10，獲得37580條有注釋信息的Unigene (表3)。其中，COG得到注釋的Unigene 12527條，GO 13878條，KEGG 11275條。

與Nr蛋白數據庫進行同源性比對，有33659條白蝦Unigene與已知基因同源，在Nr蛋白數據庫中，與蝦類相關的注釋信息較少(圖1)。相似序列比例最高為內華達古白蟻() (2787條，8%)，隨后依次是蚤狀蚤(, 1765)、隆頭蛛(, 1169)、文昌魚(, 1046)、囊舌蟲(, 1019)、紫海膽(, 965)、赤擬谷盜(, 871)、卡氏棘阿米巴(, 735)、海蠕蟲(, 644)、霸王蓮花青螺(, 605)、凡納濱對蝦(217)、羅氏沼蝦(107)、中國對蝦(, 92)和日本沼蝦(, 79)。

表4 Unigene注釋統計

Tab.4 Statistics of Unigene annotated

圖1 Nr同源物種分布

11275條脊尾白蝦Unigene注釋到KEGG，歸類為223個代謝通路，其中，基因數量排名前20的通路如圖2所示，包括核糖體、內質網中蛋白質加工、RNA轉運、剪接體、溶酶體、氧化磷酸化、糖酵解/糖異生、吞噬體、泛素介導的蛋白水解、嘌呤代謝、mRNA監測、內吞、信號通路、蛋白酶體、過氧化物酶體、真核生物核糖體生物合成、丙酮酸代謝、嘧啶代謝、檸檬酸循環和RNA降解。另外，在代謝通路中與低氧有關的還包括信號通路、信號通路、自噬調節、信號通路、癌癥通路、信號通路和精氨酸與脯氨酸代謝。

圖2 Unigene的KEGG分析

顯示基因數量排名前20位的KEGG通路

Top 20 of gene number in KEGG pathway

2.3 差異表達基因分析

低溶氧脅迫脊尾白蝦產生1392條差異表達基因，包括311條上調基因和1081條下調基因。對脊尾白蝦差異表達基因進行功能注釋，共注釋到784條差異基因，其中，COG 232條，GO 240條，KEGG 206條，KOG 460條，Pfam 587條，Swiss-Prot 542條，Nr 742條。圖3展示了白蝦差異表達基因和所有基因在GO各二級功能中的注釋情況，發現差異基因主要富集到抗氧化活性、細胞連接、蛋白結合轉錄因子活性、多細胞生物過程、復制和生殖等過程。

利用COG對脊尾白蝦差異表達基因產物進行直系同源分類，發現碳水化合物運輸和代謝、轉錄、復制、重組和修復、翻譯后修飾、蛋白質周轉和分子伴侶等4類富集的差異基因超過20個。其次，無機離子轉運與代謝、信號轉導機制、氨基酸轉運和代謝、細胞周期調控、細胞分裂和染色體分離、能量生產和轉換、翻譯、核糖體結構和生物合成、次生代謝產物生物合成、運輸和代謝等過程富集的差異基因較多(圖4)。

按照KEGG通路類型分類，脊尾白蝦差異表達基因分別注釋到環境信息處理、人類疾病、遺傳信息處理、代謝、細胞過程和有機系統6個分支。其中，遺傳信息處理、代謝和細胞過程這3大類通路中脊尾白蝦差異基因富集較多。在這些代謝通路中，泛素介導的蛋白水解和溶酶體富集的差異基因最多，分別為11和10條；其次是吞噬(4)、過氧化物酶體(4)和內吞作用(3)；另外，還包括糖酵解/葡萄糖生成(6)、精氨酸和脯氨酸代謝(4)、果糖和甘露糖代謝(4)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(4)和丙酮酸代謝(2)(圖5)。

表5為篩選出的部分脊尾白蝦差異表達基因，KOG分類注釋包括3條氨基酸的運輸和代謝基因(Amino acid transport and metabolism)、5條碳水化合物的運輸和新陳代謝基因(Carbohydrate transport and metabolism)、2條防御機制基因(Defense mechanisms)、2條能源生產和轉化基因(Energy production and conversion)、7條一般功能預測基因(General function prediction only)、6條無機離子轉運和代謝基因(Inorganic ion transport and metabolism)、3條脂質轉運和新陳代謝基因(Lipid transport and metabolism)、9條翻譯后修飾、蛋白質周轉和蛋白質伴侶基因(Posttranslational modification, protein turnover, chaperones)、1條復制、重組和修復基因(Replication, recombination and repair)、2條次生代謝物的生物合成、運輸和分解代謝基因(Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)、7條信號轉導機制基因(Signal transduction mechanisms)、1條轉錄基因(Transcription)和1條翻譯、核糖體結構和生物起源基因(Translation, ribosomal structure and biogenesis)。log2FC數值最大的為絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase)，為4.98；其次是DNA錯配修復蛋白(DNA mismatch repair protein)，為3.38。log2FC數值最小的為組織蛋白酶l (Cathepsin l)，為–6.89；其次是內切幾丁質酶(Endochitinase)，–6.58。

圖3 差異表達基因GO二級節點注釋統計

橫坐標為GO三大分類下的二級節點，縱坐標表示注釋到該節點的基因數目及占所有基因數目的百分比，紅色柱體表示所有基因的注釋情況，藍色柱體表示差異表達基因的注釋情況

The abscissa is the secondary node under the three categories of GO. The ordinates represent the number of genes annotated to the node and the percentage of all genes. The red column represents the annotation of all genes, and the blue column represents the annotation of differentially expressed genes

圖4 差異表達基因COG注釋分類

橫坐標為COG各分類內容，縱坐標為基因數目

The abscissa is the classification content of COG, and the ordinate is the number of genes

圖5 差異表達基因KEGG分類

縱坐標為KEGG代謝通路的名稱，橫坐標為注釋到該通路下的基因個數及其個數占被注釋上的基因總數的比例

The ordinate is the name of KEGG metabolic pathway. The abscissa is the number of genes annotated to the pathway and the proportion of the number of genes annotated to the total number of genes annotated

2.4 低氧脅迫對HIF1信號通路基因表達的影響

本研究中，密切相關的差異基因有4個，和缺氧時表達量上調，而抑制劑()和表達量下調。從轉錄組測序注釋到的缺氧信號通路看出，的表達受、和等信號通路關鍵因子的影響(圖6)。

表5 部分差異表達基因

Tab.5 Part of differentially expressed gene

續表5

注：FPKM：基因表達量；log2FC：基因表達量差異倍數的對數值

Note: FPKM: Gene expression level; log2FC: Logarithm of differential multiple of gene expression level

由圖7可以看出，在0~120 min內，隨著低氧脅迫時間的延長，脊尾白蝦肝胰臟、肌肉和鰓基因表達與對照組相比明顯下調；而在240 min，脊尾白蝦肝胰臟、肌肉和鰓基因表達與對照組相比，明顯上調；其中，低氧脅迫對脊尾白蝦肝胰臟基因表達影響顯著(<0.05)。在10~20 min時間范圍內，隨著低氧脅迫時間的延長，脊尾白蝦肝胰臟、肌肉和鰓基因表達與對照組相比明顯下調；其中，低氧脅迫對脊尾白蝦鰓基因表達影響顯著(<0.05)。在0~20 min時間范圍內，隨著低氧脅迫時間的延長，脊尾白蝦肝胰臟、肌肉和鰓和基因表達與對照組相比明顯下調；其中，低氧脅迫對脊尾白蝦所有組織和基因表達影響顯著(<0.05)。

3 討論

曾地剛等(2013)通過454技術對凡納濱對蝦肝胰臟轉錄組測序，獲得20225條Unigene。閆允君等(2020)利用RNA-Seq技術對中國對蝦對照組和肌肉生長抑制素()表達抑制組進行了測序分析，發現Mstn表達被抑制后共篩選到1657個差異表達基因，其中，805個顯著上調，852個顯著下調，初步篩選出29個調控的與肌肉生長相關的基因，為闡明對蝦的肌肉發育調控機制提供了重要基礎。劉欣(2016)獲得日本沼蝦Unigenes 142560條，其中，43038條獲得注釋，占總Unigene的30.20%。本研究組裝得到155113條轉錄本和118953條Unigene，獲得37580條有注釋信息的Unigene，占31.59%，其中，COG注釋Unigene 12527條，GO 13878條，KEGG 11275條，Nr 33659條；在223個KEGG代謝通路中，信號通路、信號通路、信號通路、p53信號通路、癌癥通路、自噬調節、精氨酸與脯氨酸代謝等通路與低氧脅迫有關。未獲得功能注釋的Unigene 81373條，占68.41%(表2、表3)。未注釋的原因可能與組裝的序列太短有關，轉錄組組裝的Unigene長度在500 nt以下的占總量的70.77%，增加了功能注釋的難度。另外，各類數據庫功能注釋信息不夠全面，使一些基因不能夠得到相應的注釋，例如，在Nr注釋中，白蝦Unigene僅與217條凡納濱對蝦、107條羅氏沼蝦、92條中國對蝦和79條日本沼蝦基因同源。

圖6 缺氧HIF1信號通路

紅色為轉錄組測序注釋到的Unigene

Red is the Unigene annotated by transcriptome sequencing

圖7 低氧脅迫對脊尾白蝦基因表達的影響

同一線條中具有不同字母的數據間差異顯著(<0.05)

Data with different letters in the same line is significantly different (<0.05)

機體為適應缺氧環境會誘導一些與紅細胞生成/鐵代謝、血管生成、葡萄糖代謝、細胞增殖/生存和凋亡等相關基因的表達(Terova, 2010)。本研究中，低氧脅迫產生1392條差異表達基因，784條差異基因得到注釋(表5)。GO和COG注釋表明，抗氧化活性、細胞連接、蛋白結合轉錄因子活性、多細胞生物過程、復制和生殖等過程富集的差異基因較多。與GO和COG注釋類似，富集差異基因較多的與免疫有關的KEGG通路包括泛素介導的蛋白水解，含11條差異表達基因，其次是溶酶體10條、吞噬4條、過氧化物酶體4條和內吞作用3條；而富集差異基因較多的與代謝有關的KEGG通路包括糖酵解/葡萄糖生成，含6條差異表達基因，其次是精氨酸和脯氨酸代謝4條、果糖和甘露糖代謝4條、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝4條和丙酮酸代謝2條(圖5)。這些富集的差異基因表明，低氧脅迫激活了蝦體適應缺氧的一系列生理活動，如誘導相關基因轉錄翻譯，參與應激反應，增強白蝦各類物質代謝。由表5可以看出，低氧脅迫條件下脊尾白蝦酚氧化酶原激活酶、過氧化物酶l、DNA錯配修復蛋白、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶和G蛋白信號調節因子等基因顯著上調。低氧脅迫對碳水化合物的運輸和新陳代謝基、防御機制、能源生產和轉化、一般功能預測、無機離子轉運和代謝、脂質轉運和新陳代謝、次生代謝物的生物合成、運輸和分解代謝、轉錄和翻譯、核糖體結構和生物起源等過程產生了抑制效應，表現為富集大量下調的差異表達基因。

轉錄因子是氧傳感的核心成分，還可作為許多基因的轉錄調節因子，這些基因在生理學和醫學中至關重要(McNamee, 2016; Semenza, 2012)。HIF1α抑制劑PHDs需要氧作為羥化作用的輔助因子，在正常條件下，PHDs通過PHD-HIF途徑羥基化HIF1α保守的脯氨酰殘基，從而靶向被泛素蛋白酶體降解失活。然而，在缺氧或炎癥條件下，PHD-HIF途徑失活，產生穩定的、和組成轉錄活性二聚體移位至細胞核，與缺氧調節基因的啟動子區域結合調控下游基因表達，這些區域通常是啟動子內的“缺氧反應元件”；一方面，通過激活促紅細胞生成素(EPO)基因表達促進紅細胞生成，激活血清鐵傳遞蛋白(TF)和轉鐵蛋白受體(TFRC)基因表達促進鐵代謝，激活血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子受體(Flt1)、表皮細胞生長因子(EGF)、血管生成素(ANGPT)和金屬肽酶抑制劑(TIMP1)等基因表達促進血管生成，激活血紅素加氧酶1(HMOX1)增強血管張力，通過以上調控增強氧的傳遞；另一方面，通過激活磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1(PDK1)抑制三羧酸循環代謝，激活磷酸甘油脫氫酶(GPDH)、己糖激酶(HK)、α烯醇化酶(ENO 1)、6-磷酸果糖激酶2(PFK 2)和磷酸甘油酸激酶1(PGK1)等表達促進厭氧代謝，激活B淋巴細胞瘤2()和蛋白調節增殖凋亡、降低O2消耗，通過以上調控，緩解機體對缺氧的不適(圖6)。當處于缺氧條件下，草魚()、石首魚()、黑鱸()和河鱸()一些組織中HIF1α轉錄水平顯著上調(Terova, 2010)。任倩妍等(2018)研究發現，大彈涂魚()在缺氧環境下HIF信號通路被激活，肝中低氧誘導因子表達量上調。Okamura等(2018)研究發現，日本沼蝦表達水平在缺氧刺激24 h后顯著增加，缺氧刺激6 h后腫瘤抑制劑基因表達顯著下降。與以上研究類似，轉錄組數據分析發現，和缺氧時表達量上調；低氧脅迫實時定量測定證實，在脅迫的后期，脊尾白蝦肝胰臟和鰓和明顯上調，表明脊尾白蝦細胞在低溶氧環境下誘導產生，刺激機體增加血液氧的供應能力。還激活葡萄糖轉運蛋白、糖酵解酶、血管內皮生長因子等，通過提高糖轉運和促進糖酵解以適應缺氧環境(Zhou, 2018)。周曉黎等(2018)研究發現，阻斷信號途徑，結腸癌細胞中下調，并可導致糖酵解相關蛋白如葡萄糖轉運蛋白-1和乳酸脫氫酶A的表達下降，糖酵解代謝產物乳酸含量下降。本研究中，糖酵解/葡萄糖生成通路、精氨酸和脯氨酸代謝和丙酮酸代謝富集大量差異表達基因(圖5)，也說明機體缺氧使糖酵解等無氧代謝途徑增強，同時促進了部分糖類和氨基酸的代謝。

細胞自噬通過分解代謝和再循環來消除受損或有害成分，以維持營養和能量穩態，涉及細胞質、細胞器或胞質組分的溶酶體降解；該途徑可通過多種形式的細胞應激來刺激，包括營養或生長因子剝奪、缺氧、活性氧物質、DNA損傷、蛋白質聚集體、受損細胞器或細胞內病原體(Kroemer, 2010; 馬驪等, 2018)。在自噬過程中，細胞形成雙膜囊泡、自噬體、隔離細胞器，蛋白質或部分細胞等遞送至溶酶體細胞質，溶解體中的隔離內容物被降解(He, 2009)。自噬構成了一種主要的保護機制，使細胞能夠在多種應激源的作用下存活，并有助于保護生物免受退化、炎癥、感染和腫瘤疾病的侵害(Levine, 2008; Mizushima, 2008)。在Snare蛋白及小Rab GTP激酶的作用下，自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，發揮其降解功能(徐倩等, 2017)。缺氧可通過途徑誘導自噬激活，從而調節細胞增殖和遷移，以誘導肺血管重塑(Jing, 2018)。閆廣偉等(2018)研究發現，低氧環境可能通過途徑誘導滋養細胞自噬水平增強。本研究代謝通路中，溶酶體通路、吞噬通路、過氧化物酶體通路和內吞作用通路富集的差異基因較多(圖5)，這些差異基因的表達也證實可能與缺氧引起的自噬有關。推測可通過抑制線粒體生物合成和活化線粒體自噬來降低線粒體氧耗。

綜上所述，低氧脅迫可誘導脊尾白蝦產生低氧誘導因子調控下游基因表達，進而激活蝦體適應缺氧的一系列生理活動，增強脊尾白蝦各類物質代謝，促進血管生成，增強血管張力，刺激蝦體增加血液氧供應能力；另一方面，低氧脅迫促進厭氧代謝，緩解蝦體對缺氧的不適，而低氧誘導因子可通過抑制線粒體生物合成和活化線粒體自噬來降低線粒體氧耗。

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Transcriptome Analysis ofSubjected to Hypoxic Stress

CAO Mei1, WANG Xingqiang1①, QIN Chuanxin2, SHEN Ye1, ZHANG Ziyang1, QIAN Shiyue1

(1. College of Marine Science and Fisheries, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment; South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fisheries Sciences, Guangzhou 510300)

A rapid reduction in the dissolved oxygen concentration of water is an important factor contributing to disease in shrimps. In this study, we examined differential gene expression in the shrimpunder conditions of hypoxic stress. We obtained 10.62 Gb of high-quality sequencing data, from which 155113 transcripts and 118953 unigenes were assembled. Among the unigenes, 37580 were annotated and 33659 were found to be homologous to genes in the Nr protein database. We also annotated 11275 unigenes using the KEGG database, which were further classified into 223 metabolic pathways. We detected 1392 genes that were differentially expressed in shrimps exposed to hypoxic stress, among which 311 and 1081 were up- and down-regulated, respectively, and 784 were annotated. The enrichment of differentially expressed genes in antioxidant activity, cell connection, protein-binding transcription factor activity, multicellular biological processes, replication, and reproductive processes indicated that exposure to hypoxia activated a series of physiological responses in shrimps associated with adaptation to low levels of dissolved oxygen. Among the genes up-regulated under hypoxic stress was hypoxic induction factor 1 (), which is comprised the two subunitsand. RT-PCR analysis revealed that during the latter stages of hypoxic stress, there was a notable up-regulated expression ofandin the hepatopancreas and gills of. These observations indicated thatcells induced hypoxic induction factor production in a hypoxic environment, thereby inducing an increase in blood oxygen supply. We also detected an enrichment of differentially expressed genes in the glycolysis/glucose generation pathway, arginine and proline metabolism, and pyruvate metabolism in response to hypoxic stress, which indicated an upregulation of anaerobic metabolic processes such as glycolysis, and increased metabolism of certain carbohydrates and amino acids. In addition, we detected numerous differentially expressed genes associated with the pathways involving lysozymes, phagocytosis, peroxisomes, and endocytosis inexposed to hypoxia, thereby indicating that HIFs might reduce mitochondrial oxygen consumption by inhibiting mitochondrial biosynthesis and activating mitochondrial autophagy.

; Stress hypoxic; Transcriptome analysis; Differential gene expression

WANG Xingqiang, E-mail: hyxywxq@qq.com

S917.4; S968.22

A

2095-9869(2021)02-0112-12

10.19663/j.issn2095-9869.20190924001

http://www.yykxjz.cn/

曹梅, 王興強, 秦傳新, 沈曄, 張子楊, 錢詩悅. 脊尾白蝦對低氧響應的轉錄組學分析. 漁業科學進展, 2021, 42(2): 112–123

Cao M, Wang XQ, Qin CX, Shen Y, Zhang ZY, Qian SY. Transcriptome analysis ofsubject to hypoxic stress. Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(2): 112–123

* 江蘇省海洋生物技術重點實驗室開放基金(HS16005)、廣東省漁業生態環境重點實驗室開放基金(FEEL-2019-3)、江蘇省大學生實踐創新項目(SZ201811641105001; SY201811641105001)和連云港市“海燕計劃”科研項目共同資助 [This work was supported by Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology Open Fund (HS16005), Fund of Guangdong Provincial Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment (FEEL-2019-3), Practical Innovation Project for College Students in Jiangsu (SZ201811641105001; SY201811641105001), and Lianyungang “Petrel Project” Scientific Research Project]. 曹 梅，E-mail: 593627216@qq.com

王興強，教授，E-mail: wangxingqiang@jou.edu.cn

2019-09-24,

2020-02-14

(編輯 馮小花)