基于A型塞內卡病毒VP3蛋白間接ELISA抗體檢測方法的建立

申水瑩，閆若潛，雷從從，王淑娟，馬震原，劉 影，趙雪麗，謝彩華，吳志明

(1 河南農業大學 牧醫工程學院，河南 鄭州 450002；2 河南省動物疫病預防控制中心，河南 鄭州450008；3 西北農林科技大學 動物醫學院，陜西 楊凌 712100；4 河南省獸藥飼料監察所，河南 鄭州 450002)

A型塞內卡病毒(SVA)可引起豬原發性水皰病，即塞內卡病毒病。SVA感染初期，病豬出現精神萎靡、進食困難、體溫升高等癥狀，隨后鼻、舌和蹄冠等部位出現水皰樣病變，嚴重時會蔓延至蹄底部，使病豬出現跛行的癥狀[1]。母豬感染SVA后雖然死亡率極低，但其發病率可達90%，會造成產奶減少甚至停止、餓死乳豬等生產性能上的危害。1～3日齡新生仔豬感染SVA后體態瘦弱，貪睡，不愿進食，死亡率可達 30%～70%[2-3]，給養豬行業帶來了巨大的潛在隱患。首例SVA毒株(SVV-001)于2002年由美國科研人員從細胞培養基污染物中發現并分離得到[4-5]；2002-2013年，SVA主要在美國和加拿大呈零星發生；2014-2016年，巴西、哥倫比亞和泰國均發現了豬SVA感染[6-9]。2015-2017年，塞內卡病毒病在我國廣東、福建、遼寧、湖北、河南、黑龍江等地相繼確診[10-12]，目前國內尚無針對SVA的商品化疫苗，也無特效的治療方法，一旦SVA大面積爆發必然給養殖產業帶來極大的影響。

SVA為單股、正鏈、RNA病毒[13]，屬塞內卡病毒屬Senecavirus)，與心病毒屬(Cardiovirus)成員的親緣關系較近[4,14-15]。SVA基因組含有7 280個核苷酸，包括666個核苷酸的非編碼區和一個包含6 543個核苷酸的開放閱讀框。SVA有4種衣殼蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4[16]，其中VP1、VP2和VP3位于蛋白衣殼的外部，VP4位于蛋白衣殼的內部[17]，且VP1和VP3是主要的抗原表位區域，可刺激機體產生中和抗體[4,18]。Maggioli等[19]研究發現，在SVA感染的急性期，機體產生的抗體主要是抗VP2和VP3的特異性IgM；在康復期，機體產生的抗體主要是抗VP1、VP2、VP3 的特異性IgM和IgG[6]，說明VP3蛋白在感染早期就能產生中和抗體，可作為塞內卡病毒病早期檢測的靶標抗體。

豬感染SVA的癥狀與口蹄疫、水泡性口炎和水皰性疹等水泡類疾病的癥狀十分相似，臨床上難以區分[1]，國內對SVA的檢測主要以RT-PCR為主，但ELISA方法既能達到與病毒中和試驗、間接免疫熒光等方法高度一致，又可實現SVA的快速、簡便、敏感的診斷要求，可用于大規模的流行病學研究或監測[20]。本課題組已建立了基于VP1蛋白的SVA間接ELISA檢測方法[21]，本試驗旨在進一步建立基于VP3蛋白的SVA間接ELISA檢測方法，比較基于不同蛋白建立的SVA間接ELISA檢測方法的差異，為SVA感染的臨床診斷檢測及未來疫苗免疫效果評價提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒與血清 SVA毒株及87份SVA陰性豬血清(采自健康豬，SVA熒光PCR檢測陰性)、113份SVA陽性血清(采自SVA滅活疫苗免疫的豬，病毒中和試驗檢測陽性)和160份豬血清(20頭SVA滅活疫苗免疫豬免疫后第14，21，28，35，42，49，56，63天的血清)，均由河南省動物疫病預防控制中心提供。O型和A型口蹄疫病毒 (FMDV)陽性血清，為蘭州獸醫研究所生產的阻斷ELISA檢測試劑盒中所配備。豬偽狂犬病毒(PRV) 、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)陽性血清，均為美國愛德士(IDEXX)公司生產的ELISA檢測試劑盒中所配備。

1.1.2 主要儀器和試劑 洗板機，瑞士Tecan Austria GmbH公司產品；BioTek-ELx808酶標儀，美國伯騰公司產品；蛋白超濾離心管，購于Millipore公司。病毒DNA/RNA提取試劑盒(CDC)，購于西安天隆科技有限公司；5×PrimeScript RT Master Mix、Agarose Gel DNA Extraction Kit、Plasmid Purification Kit，購于TaKaRa公司；BCA蛋白質量濃度測定試劑盒，購于碧云天生物技術公司；pGEM-T Easy Vector，購于Promega公司；JM109、BL21 (DE3)，購于康為世紀生物科技有限公司；pQE-30，購于優寶生物公司；T4連接酶、BamH Ⅰ和SacⅠ限制性內切酶、TaqDNA 聚合酶，購于寶生物工程(大連)有限公司；10×PBST、TMB單組份顯色液、Western Blot試劑盒，購于Solarbio公司；山羊抗豬HRP-IgG(H+L)，購于Proteintech公司；包涵體蛋白溶解及復性試劑盒，購于天恩澤生物科技公司。

1.2 SVA VP3基因的擴增及重組表達質粒的構建

參照GenBank中登錄的SVAVP3基因序列(GenBank登錄號為：MN885796)，設計1對特異性引物，P1：5′-TCAGGATCCCTGAACGCGAGAACCTCTAC-3′，下劃線部分為插入的BamH Ⅰ酶切位點；P2：5′-TCAGAGCTCCAAGCCTATGTCCCAAATAGA-3′，下劃線部分為插入的SacⅠ酶切位點。引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，預期擴增出的目的片段長度為717 bp。

使用病毒DNA/RNA提取試劑盒(CDC)提取SVA的總RNA，用5×PrimeScript RT Master Mix將RNA反轉錄為cDNA，備用。以合成的cDNA為模板PCR擴增VP3基因，設以ddH2O代替模板的處理為陰性對照。PCR反應體系為：Premix Taq 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上下游引物各0.5 μL，c-DNA模板3 μL。反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃停止。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后使用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收目的片段。

將VP3基因與pGEM-T Easy載體連接，構建重組質粒rT-VP3，進行藍白斑試驗篩選。對篩選出的陽性重組質粒進行PCR和測序鑒定，設以ddH2O代替模板的處理為陰性對照。將鑒定正確的重組質粒和pQE-30載體進行BamH Ⅰ和SacⅠ雙酶切，回收兩者的目的片段，用T4連接酶在4 ℃條件下過夜連接，構建重組表達質粒rpQE30-VP3。將rpQE30-VP3轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，對質粒進行PCR及BamH Ⅰ和SacⅠ雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質粒送英濰捷基(上海)貿易有限公司測序。

1.3 重組VP3(rVP3)蛋白的表達、純化及抗原性鑒定

選取鑒定過的陽性菌落，1∶100接種到LB(含氨芐青霉素100 μg/mL)培養液，在37 ℃下180 r/min培養約2 h，測定600 nm處吸光值(OD600)為0.5～0.6時(即達到對數生長期)，加入IPTG使終濃度為0.3 mmol/L，誘導6 h。取1 mL菌液4 ℃下8 000 r/min離心5 min，取沉淀進行SDS-PAGE電泳，觀察rVP3蛋白是否表達。將菌液于4 ℃下8 000 r/min離心30 min，收集菌體，于-80 ℃凍融后用裂解液重懸，超聲波裂解(功率320 W，工作3 s間歇7 s，重復至菌體完全破碎)，4 ℃下8 000 r/min離心30 min，收集上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，分析rVP3蛋白是否可溶性表達。按照包涵體蛋白溶解及復性試劑盒說明書對包涵體溶解、洗滌及復性，之后用10 K蛋白超濾管5 000 r/min離心20 min進行濃縮，按照BCA蛋白質量濃度測定試劑盒說明書測定濃縮后蛋白的質量濃度。

采用Western Blot法鑒定rVP3蛋白的抗原特異性。將經過SDS-PAGE鑒定的樣品重新進行SDS-PAGE，同時設置pQE-30轉化的產物為陰性對照，然后電轉印至硝酸纖維素膜(NC膜)。將NC膜置于封閉液(含50 g/L脫脂奶粉的PBST)中，4 ℃封閉過夜。將NC膜取出后用PBST洗膜3次，每次5 min；加入滅活的SVA陽性血清(1∶200稀釋)37 ℃孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min；加入山羊抗豬 HRP-IgG(H+L)(1∶5 000稀釋)37 ℃孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min；用ECL底物顯色試劑盒顯色。

1.4 間接ELISA方法工作條件的優化

采用矩陣法，分別對包被液[pH 7.2的PBS、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CB)]、純化的rVP3蛋白包被濃度(1，2，4 μg/mL)、封閉液(10 g/L BSA、50 g/L脫脂奶粉和5 g/L Casein)、封閉條件(37 ℃下2 h、4 ℃過夜)、樣品稀釋倍數(1∶25，1∶50，1∶100，1∶200)、TMB室溫下作用時間(5，10，15 min)、山羊抗豬 HRP-IgG(H+L)稀釋倍數(1∶2 500，1∶5 000，1∶7 500)和作用時間 (15，30，60 min)等條件進行優化。

1.5 間接ELISA方法臨界值的確定

采用上述最優條件檢測SVA陽性對照(經3次重復檢測確定P值)和200份臨床豬血清樣品(87份SVA陰性豬血清和113份SVA陽性血清)。采用SPSS 16.0軟件對200份血清樣品在450 nm處的吸光值(OD450)進行分析。以敏感性為縱坐標，1-特異性為橫坐標，使用非參數構建受試者工作特征曲線(ROC)，以Youden指數(敏感性-(1-特異性))最大點作為陰陽性判斷的臨界點，確定間接ELISA方法的判定標準。

1.6 間接ELISA方法的特異性、敏感性、重復性和穩定性檢測

1.6.1 特異性 采用已建立的間接ELISA方法分別對SVA陰性血清、SVA陽性血清以及FMDV(O/A型)、PRV、PRRSV、CSFV陽性血清進行檢測，同時設置SVA陽性對照，重復3次，分析該方法的特異性。

1.6.2 敏感性 隨機選取SVA陽性血清10份，進行病毒中和試驗；同時，對血清進行2倍倍比稀釋(1∶2，1∶4，1∶8，…，1∶512)后，采用已建立的間接ELISA方法進行檢測，分析該方法的敏感性。

1.6.3 重復性和穩定性 隨機選取SVA陰性、陽性血清共10份。用3個批次rVP3蛋白包被的ELISA反應板進行檢測；同時，采用同一批次rVP3蛋白包被的ELISA反應板，分別在3個不同的時間點進行檢測。上述試驗每份血清平行重復3次，測定OD450值。3次平行重復結果取其平均值，計算批內和批間的變異系數(CV)，分析該方法的重復性和穩定性。

1.7 血清樣品的檢測

分別采用本試驗建立的方法和課題組已建立的基于VP1蛋白的SVA間接ELISA檢測方法[21],對SVA滅活疫苗免疫豬不同時期的160份血清進行檢測，以SVA陰、陽性血清為對照，計算SVA抗體陽性率，分析兩方法間的差異。

2 結果與分析

2.1 SVA VP3基因的擴增及rpQE30-VP3的構建

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，在717 bp處獲得一條特異性片段(圖1-A)。篩選出的陽性重組質粒rT-VP3經PCR擴增，獲得一條717 bp的特異性條帶(圖1-B)；測序結果證實，rT-VP3構建成功。構建的重組表達質粒rpQE30-VP3經PCR鑒定后，獲得一條717 bp的特異性PCR擴增條帶(圖1-C)，BamH Ⅰ和SacⅠ雙酶切鑒定獲得了3 461和717 bp的條帶，與預期結果相符(圖1-D)。經測序對比分析,結果顯示目的序列無堿基插入、突變或缺失，表明重組質粒rpQE30-VP3構建成功。

A.VP3基因PCR擴增結果；B.rT-VP3質粒PCR擴增結果；C.rpQE30-VP3質粒PCR擴增結果；D.rpQE30-VP3質粒雙酶切鑒定結果。M.DNA Marker；1，3.陰性對照；2.VP3基因PCR擴增產物；4.rT-VP3質粒PCR擴增產物；5～6.rpQE30-VP3質粒PCR擴增產物；7～8.rpQE30-VP3質粒雙酶切產物A.PCR amplification results of VP3;B.PCR amplification results of rT-VP3;C.PCR amplification results of rpQE30-VP3;D.Identification of rpQE30-VP3 plasmid digested.M.DNA Marker;1,3.Negative control;2.PCR amplification products of VP3;4.PCR amplification products of rT-VP3;5-6.PCR amplification products of rpQE30-VP3;7-8.Enzyme-digested product of rpQE30-VP3圖1 SVA VP3基因及rT-VP3質粒和rpQE30-VP3質粒的鑒定結果Fig.1 Identification of SVA VP3 gene,rT-VP3 plasmid and rpQE30-VP3 plasmid

2.2 rVP3蛋白的表達、純化及抗原性鑒定

rpQE30-VP3經IPTG誘導，表達出32 ku的rVP3蛋白(圖2-A)。誘導表達產物經超聲破碎后離心，取沉淀和上清進行SDS-PAGE鑒定，結果顯示目的蛋白主要存在于沉淀中，表明rVP3以包涵體的形式表達。純化的rVP3蛋白分子質量約32 ku(圖2-B)。經Western Blot鑒定約32 ku處有特異性條帶(圖2-C)，表明rVP3蛋白能與SVA陽性血清發生特異性反應，具有較好的反應原性。經BCA試劑盒檢測，該蛋白的質量濃度為1.54 mg/mL。

A.rVP3蛋白SDS-PAGE；B.rVP3蛋白純化后SDS-PAGE；C.rVP3蛋白Western Blot。M.蛋白質標準分子量；1，6.pQE-30空載體誘導表達對照；2.未誘導的rVP3蛋白；3.IPTG誘導的rVP3蛋白；4，5，7.純化后的rVP3蛋白A.The SDS-PAGE results of rVP3;B.The SDS-PAGE results of purified rVP3;C.The Western Blot of purified rVP3.M.Protein Marker；1,6.Induction of pQE-30 empty vector；2.Uninduction of rpQE-30-VP3；3.Induction of rpQE-30-VP3；4，5,7.Purification of rpQE-30-VP3圖2 rVP3蛋白的表達、純化及抗原性分析Fig.2 Expression,purification and antigenicity analysis of rVP3 protein

2.3 間接ELISA方法最佳工作條件的優化

矩陣法試驗結果顯示，間接ELISA的最佳工作條件為：抗原2 μg/mL，碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)在4 ℃下包被14～16 h，5 g/L Casein在4 ℃下封閉14～16 h，1∶100稀釋樣品在37 ℃下反應1 h，1∶5 000稀釋山羊抗豬HRP-IgG(H+L)在37 ℃下反應30 min，TMB在室溫避光條件下反應10 min。

2.4 間接ELISA方法的判定標準

利用SPSS 16.0軟件對200份血清樣品的OD450檢測結果進行分析，繪制的ROC曲線見圖3。結果顯示，SPSS 16.0軟件數據分析Youden指數最大時所對應的OD450值，即臨界OD450為0.276，3次重復測定陽性對照的OD450為2.0。臨界OD450/陽性對照OD450= 0.138，因此，本方法的判定標準定為：樣本OD450(S)/陽性對照OD450(P)>0.138為SVA抗體陽性，反之則為陰性。

圖3 基于VP3蛋白的SVA間接ELISA檢測方法的ROC曲線Fig.3 ROC curve of SVA indirect ELISA method based on VP3 protein

2.5 間接ELISA方法的特異性、敏感性、重復性和穩定性

2.5.1 特異性 特異性檢測結果(表1)顯示，rVP3蛋白與FMDV(O/A型)、PRV、PRRSV、CSFV病原陽性血清均為陰性(S/P≤0.138)，僅能與SVA陽性血清發生反應，表明本檢測方法特異性較好。

表1 基于VP3蛋白的SVA間接ELISA檢測方法的特異性Table 1 Specificity of SVA indirect ELISA method based on VP3 protein

2.5.2 敏感性 敏感性檢測結果(表2)顯示，有6份血清樣品的結果與中和試驗一致，4份樣品最高稀釋度倍數比中和試驗僅低1個稀釋度。病毒中和試驗能夠檢測出的平均最高稀釋度為1∶150.4，而本方法能夠檢測出的平均最高稀釋度為1∶113.6。結果表明，本研究建立的間接ELISA檢測方法雖比中和試驗結果略低，但依舊有較好的敏感性。

表2 基于VP3蛋白的SVA間接ELISA檢測方法的敏感性Table 2 Sensitivity of SVA indirect ELISA method based on VP3 protein

2.5.3 重復性和穩定性 將選取的10份豬血清分別進行批內和批間重復性檢測，其變異系數(CV)分別為1.0%～3.8%和3.0%～8.0%，批內小于4%，批間小于9%(表3)，表明該檢測方法重復性和穩定性較好。

表3 基于VP3蛋白的SVA間接ELISA檢測方法的重復性Table 3 Repeatability of SVA indirect ELISA method based on VP3 protein

2.6 基于VP3，VP1蛋白的SVA間接ELISA法免疫血清檢測結果比較

采用兩種方法對SVA滅活疫苗免疫豬不同時期的160份血清進行檢測。結果顯示，在免疫后的第14，21，28，35，42，49，56和63天，VP1抗體的陽性率分別為30.00%，70.00%，90.00%，100.00%，90.00%，90.00%，85.00%和80.00%；VP3抗體的陽性率分別為35.00%，70.00%，80.00%，100.00%，90.00%，100.00%，95.00%和95.00%(圖4)，表明兩種方法均能在不同時期檢測出抗體，但抗體陽性檢出率略有差異。

圖4 基于VP3、VP1蛋白的SVA間接ELISA檢測方法的檢測結果對比Fig.4 Comparison of detection effects of indirect ELISA based on VP3 and VP1 protein

3 討 論

2015年初，我國與SVA相關的水皰病暴發并開始增多，且與新生仔豬死亡率的升高密切相關[5,22]。2015年我國廣東、福建、河南、湖北[23-24]等地陸續檢出SVA，隱性感染率極高，給我國養豬行業帶來了潛在的危害。SVA與其他水皰病在臨床癥狀上難以區分，還需要依靠實驗室診斷技術。目前國內外尚無SVA疫苗的應用，ELISA檢測出抗體陽性即為感染。而間接ELISA方法具有敏感度高、特異性強、重復性和穩定性好以及成本低、操作簡單等優點，適用于基層的檢測。目前，已有針對VP1和VP2蛋白建立的間接ELISA抗體檢測方法[21,25-26]，但市場上仍缺少商品化可用試劑盒。本研究以VP3蛋白作為包被抗原，建立了檢測SVA抗體的間接ELISA方法。本方法與常發豬病毒病陽性豬血清無交叉反應，對檢測SVA陽性血清具有特異性；陽性血清檢測結果與中和試驗基本一致，具有良好的敏感性；批內和批間的變異系數均在9%以內，具有良好的重復性和穩定性。為臨床血清SVA抗體檢測提供了成本低、操作簡單的技術手段，同時也為不同蛋白所建立的間接ELISA方法的對比奠定了基礎。評估本研究方法的敏感性時發現，其敏感性略低于中和試驗，可能是中和試驗檢測所有的中和抗體，而本方法檢測的是VP3單一蛋白的IgG抗體[6]，因而兩種試驗會產生一定差別，但是本研究建立的間接ELISA方法仍具有較高的敏感性。

采用本研究建立的基于VP3蛋白的間接ELISA方法和本實驗室已建立的基于VP1蛋白的間接ELISA方法，分別對SVA滅活疫苗免疫豬不同時期的160份血清進行檢測。結果顯示，兩種方法均能在不同時期檢測出抗體，但抗體陽性檢出率略有差異，免疫后第14天到第35天，VP1較VP3檢測出的抗體陽性率略高；從第42天至第63天，VP3比VP1檢測出的抗體陽性率略高。目前本實驗室正在進行VP2蛋白間接ELISA方法的建立，以期進行不同抗體水平的檢測。