外施γ-聚谷氨酸對辣椒生長及其鎘脅迫下生理特性的影響

鞏雪峰，李 紅，宋占鋒，賀 康，許 藝，陳 鑫，閆志英，劉獨臣，嚴奉軍

(1 四川省農業科學院 園藝研究所/蔬菜種質與品種創新四川省重點實驗室，四川 成都 610066；2 農業農村部 西南地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，四川 成都 610066；3成都市種子管理站，四川 成都610072；4中國科學院 成都生物研究所，四川 成都 610041)

農業生產中，由于磷肥、農藥的大量施用及污水灌溉，加之礦產資源的不合理開發、工業建筑垃圾亂堆亂放以及大氣沉降等原因，世界許多地方的農業土壤都受到重金屬，如Cd、Cu、Zn、Ni、Co、Cr、Pb和As的污染[1]。中國重金屬超標耕地高達232萬hm2，占總耕地面積的19.4%，其中Cd污染土壤占比高達7.0%[2]。Cd是無生物功能的金屬元素，即使較低濃度都會對植物造成毒害，導致植物生長緩慢，葉片發黃失綠，產量降低[3]。同時，Cd毒性高、移動性強，在土壤中無法被生物降解，極易被植物吸收并轉運至可食用部位，若通過食物鏈進入人體會引發多種疾病，嚴重威脅著人體健康[4]。研究表明，人體內絕大多數Cd來源于食物，尤其是蔬菜[5]，因此有必要采取有效措施來保護蔬菜免受Cd的污染。

γ-聚谷氨酸(γ-poly glutamic acid，γ-PGA)是D-谷氨酸和L-谷氨酸通過微生物發酵后由γ-谷氨酰胺鍵連接而成的高分子聚合體，具有強螯合性、生物可降解性和環境友好性等特點，已廣泛應用于醫藥、食品、化妝品及環保等行業，在農業方面的應用相對較晚[6]。研究發現，γ-PGA可以促進植物養分吸收，從而促進植物生長[7]。此外，γ-PGA可通過參與水稻幼苗的滲透調節而提高其抗旱能力[8]，可以增強甘藍型油菜脯氨酸積累，從而影響其對鹽和冷脅迫的耐受性[9]。Pang等[10]報道，γ-PGA可以有效緩解Cd和Pb對黃瓜幼苗生長的抑制，降低黃瓜幼苗對Cd和Pb的吸收?？紤]到γ-PGA的側鏈含有大量羧基，具有很強的金屬螯合能力，因此可能成為理想的穩定劑[11]，在蔬菜Cd污染治理上具有廣闊的應用前景。

辣椒(CapsicumannuumL.)是我國重要的經濟作物，全國各地均有廣泛種植。但土壤Cd污染會抑制辣椒生長，Cd超標不僅降低其品質，而且會影響人體健康[12]。目前利用γ-PGA來緩解辣椒Cd脅迫、抑制辣椒Cd吸收的研究還鮮見報道。為此，本研究分別利用水培和盆栽的方式，分析葉片噴施γ-PGA對辣椒幼苗期生長和成熟期果實產量等的影響；同時利用水培法模擬Cd污染條件，分析葉片噴施γ-PGA對辣椒Cd吸收的影響，以期為辣椒安全生產及蔬菜的Cd污染防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及育苗

供試辣椒(CapsicumannuumL.)品種川騰6號，為四川省農業科學院園藝所自育品種；γ-PGA由中國科學院成都生物研究所閆志英研究員課題組提供。試驗于四川省農業科學院園藝研究所光照溫室進行，培養條件如下：平均溫度25 ℃/18 ℃(晝/夜)，相對濕度60%，采用T5全光譜熒光燈(上海鼎鐸)為光源，光照強度300 μmol/(m2·s)，光周期16 h/8 h(晝/夜)。供試辣椒幼苗分2批進行培育，選取飽滿的辣椒種子，用體積分數10% H2O2消毒10 min，28 ℃黑暗中催芽，待根長至2～3 cm后移至裝有改良Hoagland’s營養液[13]的試管(50 mL)中，待辣椒幼苗長至6葉1心時完成育苗工作。

1.2 試驗處理

1.2.1 γ-PGA對辣椒生長及果實產量的影響 選取第1批長勢一致的6葉1心供試辣椒幼苗，一部分移栽至裝有20 L改良Hoagland’s營養液的水培箱(長×寬×高=44 cm×24.3 cm×29.8 cm)中培養，營養液每7 d更換1次，每箱栽培辣椒8株，幼苗自移栽后每隔10 d取樣測定植株鮮質量，共測6次。其余幼苗移栽至裝有基質的塑料花盆(外徑×高=17.3 cm×10.3 cm)中，基質由珍珠巖/腐殖土按質量比1∶4組配而成，經高溫滅菌后稱質量，使每盆質量保持一致，每盆栽辣椒1株, 并用改良Hoagland’s營養液澆灌；至果實成熟后測定果實結果數量、單果質量、產量、果實長度等指標。水培和盆栽苗自移栽后，各栽培方式的1/2幼苗于葉面噴施蒸餾水(對照)，另外1/2幼苗葉面噴施0.1 g/L的γ-PGA，每隔5 d噴施1次，以葉面和葉背滴水為宜(約10 mL/株)，每處理重復3次。對測定數據進行統計分析，確定γ-PGA對辣椒的作用后進行后續試驗。

1.2.2 γ-PGA對鎘脅迫辣椒生理特性的影響 選取第2批長勢一致的6葉1心供試辣椒幼苗，移栽至水培箱中，7 d后對1/2幼苗葉面噴施0.1 g/L的γ-PGA，另外1/2幼苗噴施蒸餾水作為對照，每5 d噴施1次，共噴施2次，噴施方式同上。第2次噴施完成后，以CdCl2·2.5H2O形式向改良Hoagland’s營養液中加入Cd進行Cd脅迫試驗。試驗共6個處理：加入不含Cd的營養液(Cd0)；加入不含Cd的營養液，但葉面噴施0.1 g/L γ-PGA(Cd0+PGA)；加入含5 mg/L Cd的營養液(Cd5)；加入含5 mg/L Cd的營養液，同時葉面噴施0.1 g/L γ-PGA(Cd5+PGA)；加入含10 mg/L Cd的營養液(Cd10)；加入含10 mg/L Cd的營養液，同時葉面噴施0.1 g/L γ-PGA(Cd10+PGA)。每個處理重復3次，每7 d更換1次營養液。Cd脅迫試驗5 d后進行辣椒生長及生理指標的測定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 幼苗生長及果實產量 將第1批供試幼苗的水培辣椒按1.2.1節所設定的間隔周期小心取出，紙巾拭去根部表面的水分，用電子天平測定植株鮮質量；第1批供試幼苗的盆栽辣椒待果實成熟后，用游標卡尺測定果實長度，電子天平測定果實單果質量，記錄每株植株結果數量及收果時間(d)，單株產量=平均單果質量×單株結果數。對第2批供試水培辣椒，用毫米刻度尺測定株高，并計算生長速率：植株生長速率=(鎘處理后株高-鎘處理前株高)/鎘處理時間。

1.3.2 葉綠素含量 第2批供試各處理水培辣椒自頂向下取第3～4片成熟葉片，去除葉脈后剪碎混勻，取0.20 g鮮葉，放入50 mL離心管中，加入20 mL體積分數80%丙酮，密封后于室溫下避光浸提24 h，其間搖動3～4次，待葉片完全變白后取上清液，用紫外分光光度計測定645和663 nm的吸光度值，計算葉綠素含量[14]。

1.3.3 抗氧化物酶活性 逆境脅迫條件下，植物為減少活性氧(ROS)代謝導致的傷害，其自身抗氧化物酶系統中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)等均會有所響應。但在噴施γ-PGA緩解逆境脅迫的相關研究中，主要是圍繞SOD、POD、CAT這3種酶進行分析和研究[15]。因此，本研究也僅分析SOD、POD和CAT活性的變化。第2批供試各處理水培辣椒自頂向下取第2～3片幼嫩葉片，稱取0.1 g鮮樣分別標記，液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于酶活性測定。SOD、POD和CAT酶活性均采用蘇州科銘生物試劑盒測定，每個處理重復3次。

1.3.4 葉綠素熒光參數 采用便攜式光合系統(LI-6400 XT，美國)配以葉綠素熒光葉室，測定第2批供試水培辣椒成熟葉片最大光化學效率(Fv/Fm)、實際光化學效率(ΦPSⅡ)、電子傳遞速率(ETR)、光化學淬滅(qP)和非光化學淬滅(NPQ)，光照強度設定為300 μmol/(m2·s)，氣溫25 ℃。

1.3.5 Cd及礦質元素含量 植物樣品中的礦質元素及Cd含量參考國家標準方法測定。將Cd10和Cd10+PGA處理辣椒幼苗樣品分別標記后,裝入牛皮紙袋烘干并粉碎，稱取粉碎的植株樣品0.5 g于消化管中，加入20 mL混合酸(硝酸與高氯酸體積比為4∶1)，過夜后在消解爐上高溫消解，加去離子水定容至50 mL，過濾后用電感耦合等離子體發射光譜儀(iCAP6300，美國)測定植物樣品中的Fe、Mn、Zn及Cd含量。

1.4 數據統計與分析

每個指標重復測定3次取平均值。利用Microsoft Excel 2016進行數據圖表處理，用SPSS統計分析軟件中的Duncan’s進行新復極差法多重比較。

2 結果與分析

2.1 γ-PGA 對辣椒幼苗生物量、果實形態及產量的影響

由圖1可知，在整個水培期間，施用0.1 g/L γ-PGA的辣椒幼苗整株鮮質量均高于對照，且這種促進效果隨著水培時間的延長而增強；尤其是在水培60 d時，施用0.1 g/L γ-PGA的辣椒幼苗鮮質量較對照增加了11.94%。由表1可知，葉片噴施0.1 g/L γ-PGA可以顯著提高辣椒的單株結果數、單株產量及收果時長，分別較對照增加了13.48%，15.94%和19.23%；噴施0.1 g/L γ-PGA后單果質量和果實長度雖也有所增加，但與對照差異均不顯著?？梢娛┯忙?PGA能促進辣椒的生長，提高果實產量。

圖1 γ-PGA對辣椒幼苗鮮質量的影響Fig.1 Effects of γ-PGA on fresh weight of pepper seedlings

表1 γ-PGA對辣椒果實形態及產量的影響Table 1 Effects of γ-PGA on morphology and yield of pepper fruits

2.2 γ-PGA對Cd脅迫辣椒幼苗生長速率的影響

γ-PGA對Cd脅迫辣椒幼苗生長速率的影響結果見圖2。

圖柱上標不同小寫字母表示處理間差異達到5%顯著水平，下同Different lowercase letters indicate significant difference at 5% level.The same below圖2 γ-PGA對Cd脅迫辣椒幼苗生長速率的影響Fig.2 Effects of γ-PGA on growth rate of pepper seedlings under different Cd stress

圖2表明，Cd脅迫顯著抑制了辣椒幼苗地上部的伸長生長，且Cd質量濃度越高，辣椒幼苗的生長速率降低越明顯。當Cd質量濃度為10 mg/L時，辣椒幼苗的生長速率僅為未添加Cd處理的21.63%(P<0.05)。γ-PGA能夠不同程度地促進Cd脅迫辣椒的生長，而且這種促進效果隨Cd質量濃度增大而越發明顯。當水培液中不添加Cd時，施用γ-PGA后辣椒的生長速率最大，較未添加γ-PGA處理增加了38.46%(P<0.05)；當Cd質量濃度分別為5和10 mg/L時，噴施γ-PGA處理辣椒幼苗的生長速率較未添加γ-PGA處理分別提高56.04%和68.89%。

2.3 γ-PGA對Cd脅迫辣椒幼苗葉綠素含量的影響

圖3顯示，Cd脅迫可以不同程度地降低辣椒葉片的葉綠素含量，在高質量濃度(10 mg/L )Cd脅迫下，辣椒幼苗的葉綠素a和b含量顯著低于無Cd處理。正常生長狀態下，葉片噴施0.1 g/L γ-PGA可顯著增加辣椒葉片的葉綠素b含量。在較低質量濃度(5 mg/L)Cd脅迫條件下，施用γ-PGA后辣椒葉片的葉綠素含量與未添加γ-PGA處理相比差異不顯著，且接近正常水平。而在高質量濃度(10 mg/L) Cd脅迫下，與未添加γ-PGA處理相比，施用γ-PGA后葉綠素a和葉綠素b含量顯著提高了35.46%和20.77%，而且能夠恢復到正常生長水平。

圖3 γ-PGA對Cd脅迫辣椒葉片葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of γ-PGA on chlorophyll contents of pepper seedlings under Cd stress

2.4 γ-PGA對Cd脅迫辣椒幼苗葉綠素熒光特性的影響

由表2可知，隨著Cd脅迫的加重，葉綠素熒光參數Fv/Fm、qP、ΦPSⅡ和ETR均逐漸下降，而NPQ則顯著上升,γ-PGA處理對正常生長辣椒的熒光參數無明顯影響。低質量濃度Cd(5 mg/L)脅迫下，與未施用γ-PGA相比，γ-PGA處理辣椒葉片ETR顯著增加，NPQ顯著降低，其他熒光參數無顯著變化。10 mg/L Cd脅迫使辣椒葉片的光化學效率受到顯著抑制，施用γ-PGA則能使之得到有效緩解，除Fv/Fm無顯著變化外，qP、ΦPSⅡ及ETR均顯著升高(P<0.05)，分別較未施用γ-PGA處理增加了9.52%，13.89%和13.16%；NPQ則顯著降低6.90%(P<0.05)；但總體來看，各熒光參數仍顯著低于正常生長幼苗。

表2 γ-PGA對Cd脅迫辣椒葉綠素熒光特性的影響Table 2 Effects of γ-PGA on chlorophyll fluorescence characteristics of pepper seedlings under Cd stress

2.5 γ-PGA對Cd脅迫辣椒抗氧化酶活性的影響

由表3可以看出，Cd脅迫顯著降低了辣椒葉片的抗氧化酶活性，且脅迫程度越強酶活性下降越明顯，尤其是當Cd質量濃度為10 mg/L時，SOD、POD、CAT活性較未脅迫處理(Cd0)分別降低了22.65%，24.60%和34.45%。

表3 γ-PGA對Cd脅迫辣椒抗氧化酶活性的影響Table 3 Effects of γ-PGA on antioxidant enzyme activities of pepper seedlings under Cd stress

表3顯示，施用γ-PGA可以有效緩解Cd的抑制作用。未受Cd脅迫時，施用γ-PGA可以顯著增強SOD和POD活性，但CAT活性升高不顯著；當Cd質量濃度為5 mg/L時，γ-PGA處理后辣椒葉片的SOD、POD、CAT活性分別較未噴施γ-PGA處理顯著升高了17.38%，15.72%和13.29%，SOD活性甚至提高到了正常生長水平；高質量濃度Cd(10 mg/L)脅迫下，僅CAT活性較未添加γ-PGA處理顯著提高了23.90%(P<0.05)。說明γ-PGA處理對低水平Cd脅迫下的抗氧化酶活性有明顯促進作用，但Cd脅迫程度加重時，這種促進效果有所減弱。

2.6 γ-PGA對Cd脅迫辣椒幼苗Cd及營養元素含量的影響

由表4可知，當Cd質量濃度為10 mg/L時，γ-PGA處理后辣椒植株的Fe、Mn和Zn含量分別顯著增加了24.04%，82.95%和45.68%；葉面噴施γ-PGA可以顯著抑制辣椒植株對Cd的吸收，施用γ-PGA處理辣椒的Cd含量較未施處理顯著降低了19.05%。

表4 γ-PGA對Cd脅迫辣椒養分元素及Cd含量的影響Table 4 Effects of γ-PGA on nutrient elements and Cd contents of pepper seedlings under Cd stress mg/kg

3 討 論

γ-PGA作為一種新型生物肥料增效劑，可促進植物生長和養分吸收，這已經在菠菜[16]和番茄[7]等蔬菜作物上得到了證實。盡管目前對γ-PGA促進植物生長的機制還不清楚，但已有研究發現，該過程主要通過影響植物氮代謝來完成[17]。研究發現，生長季節葉施PGA肥可促進生姜植株生長，提高植株鮮質量以及鮮姜莖塊產量[18]；葉面噴施0.1～0.3 mg/L γ-PGA可有效提高溫州蜜柑的產量和品質[19]。本研究表明，葉面施用0.1 g/L γ-PGA不僅增加了水培辣椒幼苗的鮮質量，而且明顯提高了盆栽辣椒果實數量和產量，大大延長了收果時間。因此，γ-PGA對辣椒植株生長及產量有明顯的促進作用，這與上述研究結果[18-19]一致。

葉綠素參與了植物光合作用中光能的吸收、傳遞和轉換，對植物生長起重要作用。Cd進入植物體后能夠抑制葉綠素合成相關酶的活性或直接破壞葉綠體結構，致使葉綠素合成降速或分解加快，進而抑制植物的光合作用[20]。本試驗中，在Cd脅迫下辣椒幼苗地上部生長速率明顯受到抑制，葉片葉綠素含量下降，尤其是在10 mg/L Cd脅迫下，辣椒幼苗地上部生長速率下降了近80%，葉綠素含量降低了約25%；施用γ-PGA后，葉綠素含量升高，生長速率顯著增加，說明γ-PGA能夠有效緩解Cd脅迫對辣椒葉片葉綠素合成的抑制作用?？赡苁铅?PGA具有生物可降解性，極易分解形成谷氨酸，可作為氮源供植物直接吸收利用，而氮素是葉綠素的主要成分，能夠促進葉綠素的合成以及光能的捕獲，進而促進植物的生長[21]。

Cd對植物光合系統具有破壞作用，尤其是光系統Ⅱ(PSⅡ)較光系統Ⅰ(PSⅠ)更易受到Cd的毒害[22]。葉綠素熒光反映了光合作用過程中PSⅡ對光能的吸收、傳遞、耗散和分配情況，可了解Cd脅迫對植物PSⅡ光化學活性的影響[23]。本研究表明，在5 和10 mg/L Cd脅迫下，辣椒幼苗Fv/Fm、qP、ΦPSⅡ和ETR均有不同程度降低，而NPQ顯著升高，這與賴秋羽等[24]在番茄上的研究結果相似，即Cd脅迫會導致辣椒葉片PSⅡ活性中心遭到破壞，電子傳遞受阻，熱耗散增加，且脅迫越嚴重抑制效果越明顯。本研究中，經0.1 g/L γ-PGA處理后，辣椒幼苗葉片Fv/Fm、qP、ΦPSⅡ和ETR較單一Cd脅迫處理均有不同程度升高，同時伴隨著NPQ的降低，說明γ-PGA對Cd脅迫辣椒葉片PSⅡ反應中心具有一定的保護作用，能夠緩解Cd對PSⅡ原初光化學活性的抑制作用，提高光合電子傳遞速率，降低熱耗散，使得PSⅡ天線色素吸收的光能更多更有效地用于光化學反應，維持了PSⅡ的正常功能，進而提高了Cd脅迫辣椒植株的生長速率[25]。

逆境脅迫通常會導致植物體內活性氧包括超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫的明顯增加，而較高濃度的活性氧會損傷細胞膜系統，造成氧化脅迫，進而阻礙植物生長甚至導致死亡[26]。SOD、POD和CAT是植物體內ROS清除系統的重要保護酶，在其協同作用下能夠有效清除植物體內的活性氧自由基。研究表明，Cd脅迫會導致Cd2+直接取代這些酶活性中心的金屬元素或與酶的半胱氨酸殘基結合，從而抑制酶活性[4,27]。本研究表明，Cd脅迫條件下,辣椒幼苗SOD、POD和CAT活性隨Cd質量濃度的提高而顯著下降。而張菊平等[28]的研究結果卻表明，辣椒抗氧化酶活性隨著Cd質量濃度的增加先升高后降低。這可能是辣椒品種不同所致。葉面施用γ-PGA后，不同質量濃度Cd脅迫處理辣椒的SOD、POD和CAT活性均有不同程度升高，尤其是在Cd質量濃度為5 mg/L時，抗氧化酶活性升高最為顯著。表明外源γ-PGA可以增強Cd脅迫辣椒幼苗SOD、POD和CAT的活性水平，使幼苗能更及時地清除活性氧自由基，減輕細胞的氧化脅迫，維持細胞膜的結構和功能。

作為植物生長的非必需元素，當Cd2+進入植物體內后，可取代金屬離子，如Zn2+、Mg2+和Fe2+等在金屬蛋白中的結合位點，干擾植物的離子平衡[29]。γ-PGA為一種高分子聚合物，其分子側鏈含有大量的羧基，電離產生的陰離子附著在高分子鏈上，對Ca、Mg、Cu、Zn等陽離子狀態的礦質養分具有較強的吸附和活化作用，有助于提高養分有效性[30-31]。本研究表明，在10 mg/L Cd脅迫下，葉面施用γ-PGA能顯著增加辣椒幼苗體內的Fe、Mn、Zn含量，這與黃巧義等[21]在菜心上的研究結果相似。Pang等[10]發現，施用不同濃度γ-PGA能抑制黃瓜對重金屬Cd和Pb的吸收。本研究中，葉面噴施γ-PGA后，辣椒植株Cd含量顯著降低，可能是Cd在植物體內的吸收轉運并無專用的運輸蛋白，而是與Ca、Mg、Fe等其他陽離子狀態的金屬離子競爭同一陽離子通道[32]，施用γ-PGA提高了辣椒植株體內Fe、Mn、Zn等有益礦質元素含量，因而對Cd形成競爭作用，從而抑制辣椒對Cd的吸收。

4 結 論

γ-PGA可促進辣椒幼苗生長，提高植株鮮質量和單株收果數及果實產量，延長收果時間。不同程度Cd脅迫導致辣椒幼苗代謝紊亂，生長受到嚴重抑制，葉面施用γ-PGA可提高Cd脅迫辣椒幼苗葉綠素含量及光能利用率，以及抗氧化酶活性和 Fe、Mn、Zn等有益礦質元素含量，減少辣椒對有害元素Cd的吸收，從而有效緩解Cd脅迫對辣椒幼苗造成的傷害，促進辣椒幼苗生長，而且脅迫程度越嚴重，這種緩解效應越顯著。