外源NO對低溫脅迫下伏毛鐵棒錘種子萌發及幼苗生理特性的影響

茹 剛，陳學林，于文惠，張桃桃

(西北師范大學 生命科學學院，甘肅 蘭州 730070)

伏毛鐵棒錘(AconitumflavumHand.-Mazz.)為毛茛科烏頭屬多年生草本植物，又名斷腸草、一枝蒿等，生長在海拔2 000～3 700 m山地草坡或疏林下，主要分布于甘肅、青海及寧夏南部等。伏毛鐵棒錘是藏族習用地道藥材，收錄于《中華人民共和國衛生部藥品標準(藏藥)》(第一冊)[1]。其塊根有劇毒，加工后可供藥用，主治跌打損傷、風濕性關節痛等癥。其藥用價值很高，對腫瘤也有一定療效，有很好的鎮痛作用，比嗎啡藥效強約50倍并不具成癮性[2]。目前伏毛鐵棒錘的使用價值不僅體現在醫療領域，其有效成分生物堿還是殺蟲劑的重要組分，張玉粉[3]探究了伏毛鐵棒錘生物堿對化學農藥毒殺力度的影響，結果顯示伏毛鐵棒錘生物堿和高效氯氟氰菊酯(betacyfluthrin)混配表現出較強的增效作用。此外，伏毛鐵棒錘花序長而豐滿，呈紫色或暗紫色，花期為8-9月，具有較高的園林觀賞價值。

低溫是限制植物種子萌發及幼苗生長發育的非生物脅迫因子之一，低溫不僅會引起植物莖葉形態的改變，還會使植株的正常新陳代謝紊亂，低溫超過耐受范圍甚至會造成植物體的死亡[4]。我國大面積早春凍害(又稱倒春寒)時有發生。據白城市氣象站23年的氣象記錄，4月上中旬地面氣溫低于-10 ℃的概率為22%，可見發生“倒春寒”的概率很高；2001年呼倫貝爾曾有4 000 hm2的紫花苜蓿由于受到寒流的侵襲導致大面積死亡，給當地牧民的經濟收入造成了巨大損失[5]。在我國北方地區，伏毛鐵棒錘幼苗也常受到低溫的脅迫，所以提高伏毛鐵棒錘幼苗的抗寒性勢在必行。

目前，有關外源NO對低溫脅迫下伏毛鐵棒錘種子萌發和幼苗生理學特性的影響鮮有報道。為此，本研究以伏毛鐵棒錘種子和幼苗為材料，探討外源NO對低溫脅迫下伏毛鐵棒錘幼苗膜系統穩定性、抗氧化酶活性、滲透調節物質及葉綠素含量的影響，旨在豐富外源NO對逆境脅迫下藥用植物影響的理論研究，為提高伏毛鐵棒錘幼苗的抗寒性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用種子于2018年9月采自甘肅省景泰縣老爺廟(103°49′19″ N,37°04′02″ E)，由陳學林教授鑒定為伏毛鐵棒錘種子。伏毛鐵棒錘種子在4 ℃下濕砂層積40 d破除休眠后，在SPX-150-GB型光照培養箱中培養萌發。外源NO供體硝普鈉(SNP)購自天津市北辰方正試劑廠。

1.2 方 法

1.2.1 低溫脅迫下種子發芽率、發芽勢、活力指數的測定 取大小均勻、飽滿干燥的伏毛鐵棒錘種子(50粒為1組)，在外源NO供體硝普鈉(SNP)濃度分別為0(對照,CK)，50，100，150，200，250，300 μmol/L的溶液中浸種24 h，每組處理3個重復。24 h后將種子置于覆有雙層濾紙直徑9 cm的培養皿中，以伏毛鐵棒錘種子最佳萌發溫度15 ℃為對照[9]，分別在8，4 ℃下置于SPX-150-GB型光照培養箱中培養萌發(光強：4 000 lx，相對濕度：85%，光周期：10 h黑暗/14 h光照)。并定時向培養皿中加對應溶液以確保濾紙濕潤，隨時觀察種子萌發情況，以胚芽生長長度為種子長度的1/2為萌發標準。參照劉維寶等[10]的方法，在第1粒種子萌發后每天統計發芽率，測量根長并計算活力指數。

萌發率=第30天正常發芽的種子數/供試種子數×100%。

萌發勢=第18天正常發芽的種子數/供試種子數×100%。

活力指數=∑Gt/Dt×Ls。其中，Dt為相應發芽時間，Gt為Dt時間內的出芽種子數，Ls為根長。

1.2.2 伏毛鐵棒錘幼苗的培養及處理 由于4 ℃低溫下伏毛鐵棒錘種子萌發率較低，出苗率達不到后續試驗所需，故選擇15 ℃下培養的伏毛鐵棒錘幼苗。當幼苗長出2片真葉后，在其葉面定時噴施50，100，150，200，250，300 μmol/L SNP溶液，每天1次，以蒸餾水處理為對照。3 d后將處理幼苗置于4 ℃ SPX-150-GB型光照培養箱中進行低溫脅迫試驗，每隔24 h測定幼苗相關生理指標，連續測3 d。第三天后，測定4 ℃脅迫未經緩解及4 ℃脅迫后經200 μmol/L SNP緩解過的伏毛鐵棒錘幼苗的葉綠素(a+b)含量，并觀察其表型特征，以上述15 ℃培養的伏毛鐵棒錘幼苗為對照。

1.2.3 伏毛鐵棒錘幼苗生理指標的測定 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性測定采用程艷等[11]的方法；丙二醛(MDA)含量測定采用2-硫代巴比妥酸法[12]；過氧化氫(H2O2)含量測定參照賽鬧汪青等[13]的方法；可溶性糖含量測定采用苯酚法[14]；游離脯氨酸含量測定參照李合生[15]的方法；葉綠素(a+b)含量測定按照張伏等[16]的方法。各指標均以葉片鮮質量計。

1.3 數據分析

采用SPSS 20.0和Orign 8.50軟件對試驗數據進行分析處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 SNP對低溫脅迫下伏毛鐵棒錘種子萌發的影響

SNP對低溫脅迫下伏毛鐵棒錘種子萌發的影響見圖1和圖2。

標不同小寫字母表示同一溫度下不同處理間在P<0.05水平上有顯著性差異；不同大寫字母表示同一處理下不同溫度間在P<0.05水平上有顯著性差異。圖2同Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at same temperature at P<0.05 level,and different uppercase letters indicate significant differences in same treatment at different temperatures at P<0.05 level.The same as Fig.2圖1 SNP對低溫脅迫下伏毛鐵棒錘種子萌發率和萌發勢的影響Fig.1 Effects of SNP on seed germination rate and germination potential of Aconitum flavum Hand.-Mazz under low temperature stress

由圖1和圖2可看出，經破除休眠的伏毛鐵棒錘種子，其萌發率、萌發勢及活力指數均對溫度較為敏感。與15 ℃相比，8 和4 ℃低溫下各處理組伏毛鐵棒錘種子萌發率、萌發勢及活力指數均顯著下降(P<0.05)。在8和4 ℃條件下，隨著SNP溶液濃度增大，伏毛鐵棒錘種子的萌發率、萌發勢及活力指數均呈現先升高后降低的趨勢，且均在SNP溶液濃度為200 μmol/L時達到最高；與未添加SNP組相比，8 ℃下200 μmol/L SNP處理種子萌發率、萌發勢及活力指數分別提高了16.0%，9.8%，14.0%；4 ℃下分別提高了10.4%，9.3%，11.0%。結果表明，200 μmol/L SNP溶液處理有效緩解了低溫脅迫對伏毛鐵棒錘種子萌發的影響。15 ℃下，當SNP溶液濃度小于200 μmol/L時，各處理種子的萌發率、萌發勢及活力指數間差異均不顯著(P>0.05)；8和4 ℃下隨著SNP溶液濃度增大，各處理種子的萌發率、萌發勢及活力指數相比對照均顯著提高(P<0.05)。當SNP溶液濃度高于200 μmol/L時，15，8和4 ℃下種子萌發率、萌發勢及活力指數均顯著下降，這可能是高濃度NO分子作為自由基對種子萌發造成了一定的毒害。

圖2 SNP對低溫脅迫下伏毛鐵棒錘種子萌發活力指數的影響Fig.2 Effects of SNP on seed germination vitality index of Aconitum flavum Hand.-Mazz under low temperature stress

2.2 SNP對低溫脅迫下伏毛鐵棒錘幼苗生理特性的影響

2.2.1 對SOD、POD、CAT活性的影響 SNP對4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗SOD、POD、CAT活性的影響見圖3和圖4。

圖柱上標不同小寫字母表示同時間下不同處理間在P<0.05水平有顯著性差異。下圖同Different lowercase letters indicate significant difference between treatments at same time at the P<0.05 level. The same below圖3 SNP對4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗SOD、POD活性的影響Fig.3 Effects of SNP on SOD and POD activities of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

由圖3和圖4可知，4 ℃低溫脅迫下，隨著脅迫時間的延長，伏毛鐵棒錘幼苗體內SOD、POD、CAT活性持續上升；而同時段不同濃度SNP處理SOD、POD、CAT活性均隨著SNP處理濃度的增加，呈先升高后降低的趨勢，當SNP溶液濃度為200 μmol/L時，SOD、POD、CAT活性均達到最高，此時SOD活性在24，48，72 h時間段內分別較對照顯著提高了354.61%，335.11%和309.72%，POD活性分別顯著提高了77.78%，560.00%和583.33%，CAT活性分別顯著提高了189.64%，265.44%和446.01%。結果表明，適宜濃度SNP溶液可提高低溫脅迫下伏毛鐵棒錘幼苗的抗氧化酶活性。

圖4 SNP對4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗CAT活性的影響Fig.4 Effects of SNP on CAT activities of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

2.2.2 對MDA含量的影響 由圖5可知，在4 ℃低溫脅迫下，隨著脅迫時間的延長，伏毛鐵棒錘幼苗體內MDA含量均持續增加；而同時段不同SNP處理幼苗體內MDA含量隨著SNP處理濃度的增加，呈先降低后升高的趨勢。當SNP溶液濃度為200 μmol/L時，MDA含量顯著降低，此時24，48，72 h時段分別較對照降低171.55%，131.17%，187.71%。當SNP溶液處理濃度高于200 μmol/L時，MDA含量又持續上升?？梢奡NP溶液處理濃度過高不利于伏毛鐵棒錘幼苗的生長。

圖5 SNP對4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗MDA含量的影響 圖6 SNP對4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗H2O2含量的影響Fig.5 Effect of SNP on MDA content of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃ Fig.6 Effect of SNP on H2O2 content of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

2.2.3 對H2O2含量的影響 由圖6可見，4 ℃低溫脅迫下，隨著脅迫時間的延長，伏毛鐵棒錘幼苗體內H2O2含量均持續增加；而同時段不同SNP處理幼苗體內H2O2含量隨著SNP處理濃度的增加呈先降低后升高趨勢。與對照相比，當SNP溶液濃度為200 μmol/L時，H2O2含量顯著降低，24，48，72 h分別較對照降低114.45%，67.10%，70.21%；當SNP溶液處理濃度高于200 μmol/L時，H2O2含量又持續上升。表明適宜濃度SNP有效減少了伏毛鐵棒錘幼苗體內H2O2含量，從而保護了幼苗免受H2O2等ROS的毒害作用。

2.2.4 對可溶性糖和游離脯氨酸含量的影響 SNP對4 ℃低溫脅迫下伏毛鐵棒錘幼苗體內可溶性糖和游離脯氨酸含量的影響如圖7所示。

圖7 SNP對4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗滲透調節物質含量的影響Fig.7 Effect of SNP on content of osmotic adjustment substance of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

由圖7可知，4 ℃低溫脅迫下，隨著低溫脅迫時間的延長，伏毛鐵棒錘幼苗體內可溶性糖和游離脯氨酸含量總體呈持續增加；而同時段不同SNP處理幼苗體內可溶性糖和游離脯氨酸含量均隨SNP處理濃度的增加呈先增大后減小的趨勢。當SNP溶液濃度為200 μmol/L時，伏毛鐵棒錘幼苗體內可溶性糖和游離脯氨酸含量均達最大值，24，48，72 h可溶性糖含量分別較對照增加了239.53%，205.45%，154.17%；游離脯氨酸含量分別較對照增加了170.16%，182.53%，229.57%。當SNP溶液處理濃度高于200 μmol/L時，伏毛鐵棒錘幼苗體內可溶性糖和游離脯氨酸含量又持續下降。結果表明，200 μmol/L的SNP有效促進了可溶性糖和游離脯氨酸含量的積累，作為滲透調節物質穩定了細胞水勢和膨壓，避免伏毛鐵棒錘幼苗體內生物大分子結構和功能遭到破壞，從而緩解了逆境脅迫對幼苗造成的傷害。

2.2.5 對葉綠素(a+b)含量的影響 SNP對4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗葉綠素(a+b)含量的影響見圖8。由圖8可知，4 ℃低溫脅迫下，隨著脅迫時間的延長，伏毛鐵棒錘幼苗體內葉綠素(a+b)含量持續下降；而同時段不同SNP處理伏毛鐵棒錘幼苗體內葉綠素(a+b)含量隨著SNP處理濃度的增加呈先升高后降低的趨勢。當SNP溶液濃度為200 μmol/L時，不同低溫脅迫時段伏毛鐵棒錘幼苗體內葉綠素(a+b)含量均達到峰值，24，48，72 h分別較對照增加82.35%，92.31%，111.11%；當SNP溶液處理濃度高于200 μmol/L時，葉綠素(a+b)含量又逐漸下降。表明適宜濃度的SNP可緩解低溫對伏毛鐵棒錘幼苗葉綠素合成的影響。

圖8 SNP對4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗葉綠素(a+b)含量的影響Fig.8 Effects of SNP on chlorophyll (a+b) content of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

3組不同處理伏毛鐵棒錘幼苗葉綠素 (a+b)含量見表1。由表1可知，4 ℃脅迫未經緩解的幼苗葉綠素(a+b)含量較對照降低86.76%(P<0.05)；而4 ℃脅迫經200 μmol/L SNP緩解過的幼苗較對照降低77.20%，且較未經緩解組顯著提高72.22%。從圖9也可以看出，與15 ℃下對照組幼苗相比，4 ℃脅迫后用200 μmol/L SNP緩解過的伏毛鐵棒錘幼苗葉片顏色泛黃，而4 ℃脅迫未經緩解組幼苗表現更甚。這種表型特征與葉綠素(a+b)含量變化趨勢完全吻合，表明SNP有效促進了低溫脅迫下光合色素含量的積累。

圖9 SNP對4 ℃脅迫下伏毛鐵棒錘幼苗表型特征的影響Fig.9 Effects of SNP on phenotype characteristics of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

表1 不同處理對伏毛鐵棒錘幼苗葉綠素(a+b)含量的影響Table 1 Effects of different treatments on chlorophyll (a+b) content of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings

3 討 論

低溫是植物的環境脅迫因子之一，影響植物的正常生長發育，降低產量，影響品質，給種植戶造成嚴重的經濟損失。本研究結果顯示，與對照15 ℃相比，8和4 ℃低溫處理下伏毛鐵棒錘種子的萌發率，萌發勢及活力指數均顯著降低；但施加SNP溶液后，伏毛鐵棒錘種子的萌發率、萌發勢及活力指數均呈先升高后降低的趨勢，且均在200 μmol/L SNP下達到最大值。表明適宜濃度的外源NO可有效提高伏毛鐵棒錘種子的低溫耐受性。

葉綠素是植物進行光合作用的必要色素，低溫可導致葉綠體變形，使葉綠素和類胡蘿卜素含量下降，同時低溫使光合酶活性和光合電子傳遞速率受到抑制[24]。于秀針等[25]研究發現，100～1 000 μmol/L SNP溶液均能提高番茄幼苗葉片的葉綠素及脯氨酸含量。杜曉等[26]研究指出，可溶性糖不僅是植物體進行新陳代謝所需能量的主要原料物質，而且對植物體應對逆境脅迫起到滲透調節作用。本研究結果顯示，SNP溶液濃度為200 μmol/L時，伏毛鐵棒錘幼苗葉綠素(a+b)、可溶性糖及游離脯氨酸含量顯著提高。葉綠素(a+b)含量提高使得伏毛鐵棒錘幼苗能正常進行光合作用，可溶性糖和游離脯氨酸含量增加能夠穩定細胞水勢和膨壓，進而降低細胞冰點，避免伏毛鐵棒錘幼苗體內生物大分子結構和功能遭受破壞。

4 結 論

施加適宜濃度的外源NO(SNP溶液)可提高伏毛鐵棒錘種子對低溫的耐受性；SNP溶液最佳濃度為200 μmol/L；伏毛鐵棒錘幼苗可通過調節抗氧化酶活性來清除由低溫脅迫積累的過?；钚匝醯扔泻ξ镔|；通過增加滲透調節物質含量降低細胞冰點，進而減少細胞結冰，避免體內生物大分子結構和功能遭受破壞。