黃綠蜜環菌的研究進展*

劉西周，王潤楠

（天津師范大學生命科學學院，天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

黃綠蜜環菌（Armillaria luteo-virens），又名黃蘑菇、皇菇、雙環菌，屬于擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱 （Hymenomycentes）口蘑目 （Tricholomatales）口蘑科 （Tcholomataceae）蜜環菌屬（Armillaria），主要分布于青藏高原地帶[1]，作為我國重要的高原生物資源，近年來被科研工作者廣泛關注。通過全面綜述黃綠蜜環菌的研究進展，以對其發展前景進行展望。

1 形態學特征

1997年刁治民[2]提到，黃綠蜜環菌菌蓋呈扁平狀，菌蓋邊緣內卷，新鮮時菇體表現為檸檬黃色至琉璃色，不等長；菌柄內實，長2 cm～8 cm，直徑2.0 cm～2.5 cm，呈圓柱狀，白色至黃色，莖部膨大背陽處晾干呈近白色，不粘，鱗片明顯，菌蓋5 cm～12 cm；菌肉肉質細膩，白色至淺黃色，傷后不變色，有特殊的菌香氣味；菌褶黃色，大多直生，少數彎生至菌蓋；內菌明顯，白色至淺黃色，棉絮狀至近膜質，在菌環形成后消失；菌環單層，以上為白色，以下為黃色。

通過顯微鏡觀察孢子體，可以發現擔孢子呈橢圓形，無色至淺黃色，淀粉質，（6.4～7.8）μm ×（4.0～4.8）μm；擔子棒狀，（22～28）μm ×（4.0～5.4）μm，無色，具4孢，菌絲具有明顯的鎖狀聯合[2]。

2 生態環境

2.1 自然分布

黃綠蜜環菌主要分布于我國的西南地區，尤其是青藏高原地帶，甘肅、四川、陜西、河北也有少量分布，夏秋季生長在低溫、高海拔的蒿草草甸或草原上，單生、散生、野生，常形成蘑菇圈[3]。在青海，黃綠蜜環菌分布于3 000 m～4 300 m高海拔地區，3 200 m～3 800 m的草甸上更為集中，主要產于果洛、海南、黃南、海北。近幾年，關于黃綠蜜環菌的自然分布也有了新的論述，趙聯正[4]在2015年提到，黃綠蜜環菌分布范圍為北緯 28°93′～37°69′、東經 90°4′～102°1′，這與蒿草屬植物的分布相吻合，而在陜西、河北則沒有分布。

2.2 氣候因子

2.2.1 氣溫

黃綠蜜環菌由于分布于3 000 m～4 300 m的高海拔地區，生長區較為寒冷，菌絲生長的草場氣溫在一年中有5個月～8個月在0℃以下，每年的5月至9月為牧草的青草期[5]。據周勁松[6]研究，野生黃綠蜜環菌分布區的年平均氣溫為0.8℃（剛察）至-4.2℃ （瑪多），最冷月氣溫為-14.2℃ （剛察）、-16.9℃ （瑪多），最熱月氣溫為 10.6℃ （剛察）、7.6℃ （瑪多），氣溫年較差為 24.8℃ （剛察）、24.5℃（瑪多），年平均降水量為377.1 mm（剛察）、282.8 mm（瑪多）。春季干旱。

2.2.2 降水

每年的7月中旬至8月下旬為出菇期，降雨周期和降雨量對黃綠蜜環菌的發生時間、發生量產生重要影響。如果降雨早、降雨量多并且集中，則子實體發生早，產量也會提高，子實體發生期的雨量為300 mm～500 mm[7]。在青藏地區，每年的6月～8月降水較多，約占年降水量的70%[7]。由于黃綠蜜環菌牧草生長期短，生長的草甸氣溫低，蒸發量較少，所以保持水分對菌絲生長起著重要作用，每年8月降水次數多，有助于提高黃綠蜜環菌的產量，每公頃可產子實體 600 kg～900 kg[7]。

2.2.3 土壤

于是除了沉潛于作畫（僅1958年就創作了200多幅作品，可謂是一個人的大躍進）潘天壽再次有了辭職的念頭，卻未能如愿，他不知道，在毛澤東那個講話后，即使有人真對他有意見，也不敢輕易動他，所以越請辭越升職。

黃綠蜜環菌生長在高山草甸土，腐殖質層10 cm～20 cm，土壤顏色較深，呈中性或偏堿性，腐殖質層以下為母質，含草根、礫石[2]。在雨后，該土不會產生積水，長時間干旱后仍然保持濕潤，特別適宜黃綠蜜環菌的生長。通過對祁連縣黃綠蜜環菌生長區土壤進行成分測定，結果為速效氮445.6 mg·kg-1、速效磷 5.86 mg·kg-1、有機質 8.84%、全氮 0.415%、全磷0.079 4%[2]。蘑菇圈土壤各營養成分含量對比詳細數據見表1。

表1 蘑菇圈土壤各營養成分含量對比Tab.1 Contents of soil nutrients on fairy ring of Armilaria luteo-virens and outside of ring

由表1可知，在青海省祁連縣峨堡鄉，王啟蘭等[8]通過調查發現在0～10 cm土層中，蘑菇圈上的土壤含水量、氨態氮、硝態氮、速效磷的含量明顯高于圈外，交換性Mg2+、交換性Ca2+、土壤有機質和pH則沒有明顯差別；在10 cm～20 cm土層中，土壤含水量變化趨勢相反，其與趙勇斌[9]的觀點相吻合。蘑菇圈土壤微生物數量對比詳細數據見表2。

表2 蘑菇圈土壤微生物數量對比Tab.2 Numbers of soil microorganisms on fairy ring and outside of ring

由表2可知，王啟蘭等[8]也調查了峨堡鄉土壤中微生物的數量，發現在0～10 m土層，蘑菇圈上細菌、真菌、放線菌的數量，都顯著高于圈外（P＜0.05），但是在10 cm～20 cm土層，微生物數量差異并不顯著（P＞0.05）。當土壤深度不斷增加時，各種微生物的數量、種類迅速下降，在2層土壤中細菌數量最高，其次是放線菌，真菌的數量最低。

2.3 植被

黃綠蜜環菌生長發育的植被均為草本，主要生長在高寒草甸、高寒草原等植被類型中。黃綠蜜環菌共生植物均達到8種～17種，黃綠蜜環菌共生植物優勢種為矮蒿草 （Kobresia humilis）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）、羊茅 （Festuca ovina）、高山蒿草（Kobresia pyymaea）、甘肅棘豆（Oxytropis kansuensis）、青海固沙草 （Orinus kokonorica）、柄狀苔草（Carex pediformis）等，通過研究子實體具體發生的部位，可以看出黃綠蜜環菌與蒿草屬和苔草屬共生植物的根系形成了菌根關系[10]。研究發現黃綠蜜環菌生長區域出現了明顯的“帶狀”增綠顏色，發現增綠帶的Ca、P元素含量以及葉綠素明顯高于非增綠帶，其他指標略低于后者，這似乎意味著黃綠蜜環菌存在具有某種促進草增綠的機制，或者在生長過程會分泌將草變綠的化學物質，關于這一論點還需要進一步探索。通?！皫钊Α钡闹睆酱蠹s為6 m，寬度為20 m～30 m，圈上植物顏色更深，生長更茂盛。圈上一共有26種植物，平均總蓋度位為90.2%，各物種分蓋度總和為 143.72%[11]。

3 成分分析

3.1 營養成分

黃綠蜜環菌營養豐富，通過分析子實體的干樣品，發現每100克干樣品中，存在干物質95.29 g、粗蛋白質 38.71 g、粗脂肪 15.28 g、粗纖維 8.04 g、無氮浸出物 25.13 g、灰分 8.13 g、鈣 0.13 g、磷0.64 g、總熱量 18 045 J·g-1[2]。此外，氨基酸種類也十分豐富，存在18種氨基酸，含有較多維生素，VB1含量 1.84 mg·g-1、VB2含量 8.25 mg·g-1、VC 含量 12.81 mg·g-1、鐵含量 329 mg·kg-1[2]。通過對比祁連、澤庫、瑪沁數據，可以發現不同產地的黃綠蜜環菌營養物質成分不同。

3.2 礦質元素

魏永生等[12]利用全譜直讀電感耦合等離子體發射光譜法（inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICP-OES），詳細分析、測定了礦質元素含量，黃綠蜜環菌共含有17種礦質元素K、P、S、Mg、Ca、Fe、Al、Na、Zn、Cu、Mn、Cd、Ti、B、Ba、Cr、Sr，其中K、P、S的含量較高；此外，微量元素Fe、Zn、Cu等含量較高，同時含有一定量的Cd元素，但是并未檢測出Se元素。

3.3 有效成分

關于黃綠蜜環菌有效成分的研究較多，主要是經過水提取或者有機溶劑提取、分離子實體，經過現代儀器設備純化、鑒定，對子實體進行定性定量分析，分離蛋白質、氨基酸、揮發性物質等，確定有效成分。

白世俊等[13]將黃綠蜜環菌子實體分別進行水提取、醇提取、石油醚提取等方法，定性分析了其化學成分，表明該菌含有較豐富的糖類、生物堿、氨基酸、蛋白質和少量皂苷、強心苷、苷類、甾體三萜類、有機酸、黃酮等，而香豆素萜類、揮發油、鞣質、酚類極少。馬琳等[14]利用反向/親水二維制備液相色譜法，獲得子實體水提取物，分離純化得到單體化合物，經過鑒定確定了7個有效成分焦谷氨酸、尿嘧啶、2’-脫氧尿苷、尿苷、肌苷、腺苷、鳥苷，這7個化合物均為首次分離得到。唐楚沉等[15]將黃綠蜜環菌子實體進行了丙酮提取，先用固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）技術進行預處理，再采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）法進行分析，最終鑒定出33個化合物，主要是烯類、酯類、脂肪酸類等化合物，其中含量最高的是亞油酸（48.2%），其次含量較高的有鄰苯二甲酸丁辛酯（12.1%）、順式-11-十八碳烯酸（7.1%）、鄰苯二甲酸單酯（7.3%），其余成分均在5%以下。

劉葳等[16]通過80℃水浸提，sevagHO2溶液脫色，體積分數為95%的酒精沉淀得到粗多糖GLP，產率為1.72%；通過純化得到2種白色粉末狀多糖粗品阿拉伯糖和木糖，該多糖由α-D-木吡喃糖、β-D-阿拉伯吡喃糖組成，連接方式以1、4連接為主鏈，1、6連接為支鏈。魏永生等[17]利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術（headspace solid-phase micro-extraction gas chromatography mass spectrometry，SPME-GC-MS），研究了黃綠蜜環菌子實體的揮發性成分，發現揮發性物質中含量最高的是3,7－二甲基癸烷 （13.89%），其次是姜烯（9.10%）、2,3-二甲基十二烷 （8.76%）、佛手柑油烯 （4.62%）、十八烷（3.65%）、2-壬酮 （3.41%）、2,3,5,8-四甲基癸烷（2.89%）、姜黃烯 （2.83%）、6-辛烯-2-酮（2.80%）、β-紅沒藥烯 （2.42%）。周勁松等[18]通過應用氣相色譜-質譜聯用技術，研究了黃綠蜜環菌子實體的揮發油成分，發現了13種成分，主要是不飽和脂肪酸，如N-苯基-1-萘胺、C14酪、麥角甾-7-烯,3-醇等。索朗央宗等[19]先采用氯仿-甲基叔丁基醚提取黃綠蜜環菌中的總脂肪酸，通過硫酸催化甲酯化后，再用氣相色譜-質譜聯用對其進行檢測，最終有16種脂肪酸被分離檢測出，其中飽和脂肪酸有9種，棕櫚酸（25.32%）、硬脂酸（12.61%）含量較高，不飽和脂肪酸有7種，油酸（28.33%）、γ-次亞麻油酸（23.14%）含量較高。

4 分子生物學研究

利用現代分子生物學技術研究黃綠蜜環菌，可以對其發展、保護、馴化有重要作用。李海波等[20]運用rDNA-ITS和rDNA-IGS-1測序技術，對黃綠蜜環菌進行分子鑒定、序列比對、構建系統發育樹，結果表明：對黃綠蜜環菌進行ITS系統發育分析后發現其與口蘑科內其他屬間物種的系統發育關系較遠；再將其進行IGS-1系統發育分析，發現其與蜜環菌屬的其他種有較大的序列差異，系統發育關系也較遠，但是其與環柄菇屬（Lepiota）有較近的系統發育關系。李穎等[21]以CTAB法提取的黃綠蜜環菌DNA為模板，通過正交設計試驗，建立了適合黃綠蜜環菌SSR-PCR反應的最佳體系，在15 μL反應體系中包括 1×PCR Buffer，模板 DNA 100 ng，dNTPs 217 μmol·L-1，引物 0.5 μmol·L-1，Taq DNA聚合酶 0.75 U，Mg2+1.3 mmol·L-1。同時還從 34 對引物中，篩選出8對多態性豐富、擴增條帶清晰的SSR引物。邢睿等[22-23]利用454焦磷酸測序技術，對黃綠蜜環菌轉錄組進行測序，通過設計、PCR擴增、電泳、檢測，篩選出符合要求的微衛星引物。并利用采集自3個不同居群的66個個體對成功開發出27對具有多態性條帶的微衛星引物進行試驗，有17對引物符合Hardy-Weinberg平衡且沒有連鎖不平衡現象，開發的EST-SSR引物為黃綠蜜環菌遺傳多樣性分析、種質資源鑒定及遺傳圖譜的構建奠定了基礎。當前，關于黃綠蜜環菌的分子生物學研究依然很少，隨著科學的不斷發展，未來的重點與難點將會在分子水平上研究其子實體的生長發育。

5 菌絲體培養

關于黃綠蜜環菌的菌絲體培養，近幾年一直都不斷有報道，大致有2個方向：控制單一變量，篩選菌絲體培養的最佳碳源、氮源、碳氮比、溫度、pH和最適宜培養條件；將一些物質如鹽溶液、生長調節劑、中草藥浸提液加入到培養基中，觀察菌絲體生長情況（促進、抑制或無影響）。

刁治民[24]最早在1997年提到，黃綠蜜環菌對碳源利用廣泛，葡萄糖、蔗糖、淀粉是理想碳源；對氮源的利用率，復合有機氮源＞單一有機氮源＞銨態無機氮源＞硝態無機氮源，對硝態氮的利用率低，甚至基本上不利用；添加維生素、CuSO4、MgSO4等物質時，可以促進菌絲體生長；在無碳源或氮源培養基上不生長。此外，不同的碳氮比也會讓菌絲體生長產生差異，當碳氮比范圍為5∶1～80∶1時，菌絲體可以生長，最佳碳氮比為35∶1[25]。柳煥章等[26]對黃綠蜜環菌菌絲體培養進行了初步探索，通過試驗篩選出了適宜的溫度和pH，菌絲體在10℃～35℃可以生長，適宜溫度在25℃～30℃；在pH為4～10的環境下可以生長，適宜pH大約為6～7。蔡簫等[27]通過人工馴化黃綠蜜環菌，發現菌絲體生長的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為蛋白胨，適宜的碳氮比為10∶1，最佳礦質元素為MgSO4，最適pH為6.5，暗培養最佳。史強強等[28]以母種為材料，通過單因素試驗、正交設計，通過測量菌落直徑和菌絲體干重，篩選出了菌絲最佳培養條件，即馬鈴薯浸出液20%、黃豆芽浸提液 10%、KH2PO40.3‰、VB1和 VB2各 1 mg·L-1。

周勁松等[29]使用了2種生長調節劑（三十烷醇、肌醇）對黃綠蜜環菌菌絲體進行研究，結果發現2種生長調節劑對菌絲生長都有促進作用，但是三十烷醇更明顯地提升菌絲體的生長速度。周連玉等[30]將野菊花、枸杞、靈芝、鎖陽、甘草、當歸等中草藥浸提液加入到培養基中，進行菌絲體培養，結果發現靈芝抑制菌絲體生長，其余草藥促進菌絲體生長，甘草和枸杞有較強作用，最佳添加量均為4.0%。此外，在液體培養基加入Na2SeO3，發現當濃度為0.80 mmol·L-1時，黃綠蜜環菌菌絲體生長最好，硒可以促進菌絲體生長，在培養的第4天加入亞硒酸鈉最適宜，培養7 d可以顯著提高菌絲生物量[31]。

6 發酵工藝

目前，關于黃綠蜜環菌發酵工藝的報道不多，肖前青[4]對菌絲體多糖發酵進行研究，獲得了多糖發酵模型方程，得到優化條件為蔗糖5 g·L-1、草酸銨0.5 g·L-1、牛肉膏 0.5 g·L-1、K2HPO43 g·L-1、VB10.05 mg·L-1，并初步總結了多糖發酵工藝和提取工藝。王虹等[32]通過正交試驗法，分析了2種不同培養基對黃綠蜜環菌液體發酵產胞外多糖的影響，獲得了黃綠蜜環菌胞外多糖較優的精制培養基組成：馬鈴薯 200 g·L-1、酵母膏 2 g·L-1、葡萄糖 40 g·L-1、硫酸鎂 0.5 g·L-1、磷酸二氫鉀 1.5 g·L-1、維生素 B112 μg·L-1，pH 6.0。余梅[33]通過研究 70 L 發酵罐中的液體培養動力學，建立了液體培養菌絲體的動力學模型。史強強等[34]通過考察搖瓶裝量、攪拌速度、發酵時間、接種量等指標，并通過正交設計試驗，確定了最優深層發酵工藝參數：搖瓶裝量300 mL·L-1、攪拌速度125 r·min-1、發酵時間10 d、接種量15%，為黃綠蜜環菌的工業化生產提供了理論支持。

7 應用價值

7.1 藥用價值

黃綠蜜環菌作為一種重要的食藥兼用菌，營養豐富、香氣撲鼻，含有豐富的蛋白質，平均100 g干樣品中就存在蛋白38.71 g，且氨基酸、維生素種類豐富，還含有鐵、鋅、銅等微量元素，特別是硒元素含量很高[7]。硒元素對汞、鎘等重金屬有解毒作用，可以調節氧化還原反應速率，調節人體消化、吸收維生素，增強某些酶系統的活性，是人體谷胱甘肽過氧化物酶的活性成分[35]。此外，黃綠蜜環菌具有補充人體營養、促進食欲，預防腳氣病、神經炎，抗流感病毒，促進小兒發育等重要作用，其有效成分的提取物可以直接作為殺傷腫瘤細胞的天然抗腫瘤活性物質[36]。在清朝年間，黃綠蜜環菌被用來當做貢品，目前市場上干品價格超過了300元/kg，出口更昂貴，出現供不應求的局面，這為市場帶來了機遇和挑戰[7]。

7.2 生態價值

黃綠蜜環菌是與牧草共生的菌根菌，其可以促進牧草的生長和發育，在蘑菇圈上形成“增綠帶”。許多證據表明黃綠蜜環菌蘑菇圈上的物種豐富度明顯高于圈外，圈上的土壤含水量、氮元素、磷元素含量也高于圈外。黃綠蜜環菌可以降解木質素、半纖維素等物質，增加土壤中小分子、無機離子的含量，促進圈上植物、微生物的成長；同時，菌絲體的生長也需要植物激素的刺激，需要植物根系分泌物、殘體來維持；黃綠蜜環菌作為分解者，在生長過程中需要O2，釋放CO2，而植物在發育中，則需要CO2，釋放出O2，這說明植物的生長、微生物的活動和土壤養分的轉化是相互依存、相互促進[8，37-38]。

8 前景展望

由于黃綠蜜環菌生長在青藏高原，還沒有進行充分地開發利用，目前可以從人工馴化、物種保護、深加工工藝等方面開展研究。

8.1 人工馴化

黃綠蜜環菌是與牧草共生的菌根菌，這給人工馴化帶來了不小的難度，近些年主要研究其菌絲體培養，但目前為止還未發現成功出菇的案例，進度比較緩慢。目前人工馴化的主要問題有：菌絲體生長速度慢、繁殖效率低、生長周期長；菌絲長勢弱，污染率高，抗雜菌能力差；對黃綠蜜環菌生長機制了解不充分。因此，應該進一步了解黃綠蜜環菌的生活史、生態特性，研究其與牧草之間的共生體系，不斷探索，償試開展半人工馴化原生態生產。一旦成熟掌握人工栽培技術，不僅能促進黃綠蜜環菌在全國范圍的推廣、銷售，帶來重大的經濟效益，而且會促進青藏地區其他物種的開發，帶來更大的社會效益。

8.2 物種保護

綠蜜環菌生長環境獨特，且純屬野生，每年的產量都很低，近幾年由于人工大量開采和人為破壞，野生黃綠蜜環菌的產量在逐年降低，甚至瀕危匱乏[11]，長此以往，將對黃綠蜜環菌的生長和繁衍產生重要危害。為了保護物種多樣性、加強對黃綠蜜環菌的進一步持續開發，必須處理好人與菇的關系，注重長遠利益，不要過度開采，妥善處理好人與自然的關系。

8.3 深加工工藝

黃綠蜜環菌集營養、藥用、保健價值于一體，一直深受消費者青睞，市場的需求也不斷增加，但是對其開發和利用一直處于起步階段，如何充分有效地利用黃綠蜜環菌成為了當前最重要的課題之一?？梢酝ㄟ^鹽漬、油漬、糖漬等方式，將黃綠蜜環菌做成罐頭或者其他風味食物，比如餅干、香腸等；也可進一步研究利用黃綠蜜環菌子實體，萃取而獲得多糖，多糖具有很多功效，如健胃保肝、降血脂、抗血栓、降血壓、免疫調節、抗腫瘤等[1]，可以將其制成藥物制劑、保健品、飲料。這樣既降低了保鮮成本，方便了人們的利用，也有助于黃綠蜜環菌的推廣，為青藏地區的農民提供一條致富門路。