MSP58低表達對垂體瘤細胞AtT-20增殖、侵襲和遷移的影響

高海鋒,董秋鋒,姬西團,高大寬,黃 鋼*

(1西北大學附屬醫院,西安市第三醫院神經外科,西安 710018;2空軍軍醫大學第一附屬醫院神經外科;*通訊作者,E-mail:qijiazai10692086@163.com)

垂體瘤是起源于腺垂體細胞的中樞神經系統常見腫瘤,占顱內腫瘤的27%-30%[1]。99.8%的垂體瘤為良性腫瘤,但少數垂體瘤具有侵襲性生長的惡性腫瘤生物學特征,能向周圍組織侵襲性生長,破壞鞍區骨質、海綿竇等鞍區結構,手術治療難以將其完全切除,術后復發率高達30%,死亡率較高,嚴重威脅患者生命健康[2-4]。垂體瘤細胞的侵襲性生長受基因調控、細胞基質降解等多種因素影響,與腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等過程密切相關。因此,探討垂體瘤生物學行為的分子機制,對于垂體瘤治療具有重要意義。核微球蛋白58(nucleolar 58-kD microspherule protein,MSP58)是一個癌基因,可以被癌基因v-jun特異誘導表達,并引起細胞的惡性轉化[5]。既往研究發現,MSP58在胃癌、膠質瘤中高表達,與胃癌患者預后、膠質瘤惡性程度密切相關[6,7],且干涉其表達可抑制肺癌增殖、侵襲等惡性表型[8]。但MSP58對垂體瘤細胞生物學行為的影響尚缺乏研究,本研究將通過下調MSP58表達,研究其對垂體瘤細胞AtT-20增殖、侵襲、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人垂體瘤AtT-20、GT1-1、GH3細胞(貨號:XY-XB-2707、ZY-M057、YB-ATCC-4993)購自美國ATCC細胞庫;HP75細胞(貨號:CE23928)購自北京科瑞思搏生物科技有限公司;胎牛血清(貨號:FBS500-S)購自澳大利亞AusGeneX公司;RPMI-1640培養液(貨號:GNM-31800)購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司;Lipofectamine 2000轉染試劑、TRIzol試劑盒(貨號:11668019、15596018)購自美國Invitrogen公司;對照siRNA、針對MSP58的特異siRNA與MSP58、β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)試劑盒、MTT溶液(貨號:ALH197-VNA、GL0247-RXS)購自北京百奧萊博科技有限公司;Matrigel基質膠(貨號:356234)購自美國BD公司;Transwell小室(貨號:SPL-36224)購自北京孚博生物科技有限公司;結晶紫(貨號:0528-100G)購自美國Amresco公司;MSP58抗體(貨號:IC186993)購自上海鈺博生物科技有限公司;增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2抗體、MMP-9抗體、三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(貨號:ab18197、ab235167、ab73734、ab181602)購自Abcam公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(貨號:0295G-HRP)購自美國Santa公司;恒溫培養箱(型號:TY10GI2-2)購自美國Shellab公司;熒光定量PCR儀(型號:ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司;酶標儀(型號:MODEL550)購自美國Bio-Rad公司;顯微鏡(型號:CX31)購自日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 AtT-20、HP75、GH3、GT1-1細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基,在37 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度的培養箱中常規培養,每1-2 d換液1次,每3 d離心收集傳代1次。傳代3次后取對數生長期細胞用于以下實驗。

取生長良好的對數生長期AtT-20細胞,以2.0×105個/孔接種于96孔或24孔培養板,分為對照組、NC-siRNA組和MSP58-siRNA組,每組3個復孔。常規培養到細胞融合率達75%,NC-siRNA組和MSP58-siRNA組AtT-20細胞用Lipofectamine 2000轉染試劑分別轉染對照siRNA和針對MSP58的特異siRNA。

1.2.2 qRT-PCR法檢測AtT-20細胞中MSP58 mRNA表達情況 將AtT-20細胞轉染后培養24 h,離心收集細胞,按照TRIzol試劑盒說明書提取細胞總RNA,并逆轉錄合成cDNA,反應程序:37 ℃×15 min,85 ℃×5 s,4 ℃。以cDNA為模板,按照qRT-PCR試劑盒說明書步驟檢測MSP58 mRNA表達水平,結果以2-ΔΔCt法表示,內參基因為β-actin。反應程序:95 ℃×5 min;94 ℃×30 s,58 ℃×30 s,72 ℃×1 min,循環32次。MSP58上游引物:5′-ACGCCCTGCTCTACGAT-3′,下游引物:5′-TCATGCCTGTGATGCTGTC-3′;內參β-actin上游引物:5′-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3′,下游引物:5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。

1.2.3 MTT法檢測AtT-20細胞增殖情況 設置空白組(添加不含細胞的RPMI-1640培養基),將空白組及1.2.1中各組細胞轉染后分別培養24,48,72 h,加入20 μl MTT試劑,培養4 h后終止培養;棄培養基,加150 μl二甲基亞砜,待結晶完全溶解后,使用酶標儀檢測在波長450 nm處的吸光度(optical density,OD)值,計算細胞增殖率。細胞增殖率(%)=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.2.4 Transwell法檢測AtT-20、HP75、GH3、GT1-1細胞侵襲情況 將AtT-20、HP75、GH3、GT1-1及1.2.1中轉染后的各組AtT-20細胞用胰酶消化,用無血清培養基配制為1×103個/ml的細胞懸浮液。用無血清培養基稀釋Matrigel基質膠,向Transwell小室中鋪50 μl,室溫凝固;Transwell小室上室加200 μl細胞懸浮液,下室加500 μl 10%胎牛血清的RPMI-1640培養基,置于培養箱中常規孵育24 h;取出Transwell小室,用無菌棉簽擦去未穿膜細胞,4%多聚甲醛固定15 min,0.5%結晶紫染液染色20 min,200倍鏡下隨機選取6個視野,觀察拍照,統計侵襲細胞數。

1.2.5 Transwell法檢測AtT-20細胞遷移情況 用胰酶消化轉染后的AtT-20細胞,用無血清培養基配制1×103個/ml的細胞懸浮液,向Transwell小室上室加200 μl,下室加500 μl含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基,培養箱中常規孵育24 h;擦去未穿膜細胞,4%多聚甲醛固定15 min,0.5%結晶紫染液染色20 min,200倍鏡下隨機選取6個視野,觀察拍照,統計遷移細胞數。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測AtT-20細胞中MSP58、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達情況 將AtT-20細胞轉染后培養24 h,離心收集細胞,裂解細胞提取總蛋白并進行定量。行電泳、轉膜、封閉,加入一抗(MSP58抗體、PCNA抗體、MMP-2抗體、MMP-9抗體、GAPDH抗體,均1 ∶800稀釋)孵育過夜,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1 ∶2 000稀釋)室溫孵育1 h,顯色、顯影,拍照、分析條帶灰度。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 AtT-20、HP75、GH3、GT1-1細胞侵襲情況

各個垂體瘤細胞系中,AtT-20細胞侵襲細胞數均高于HP75、GH3、GT1-1細胞(見圖1、表1)。

圖1 AtT-20、HP75、GH3、GT1-1細胞侵襲情況

表1 AtT-20、HP75、GH3、GT1-1細胞侵襲細胞數

2.2 各組AtT-20細胞中MSP58 mRNA表達情況

NC-siRNA組與對照組AtT-20細胞中MSP58 mRNA表達水平相比,差異無統計學意義(P>0.05)。與NC-siRNA組相比,MSP58-siRNA組AtT-20細胞中MSP58 mRNA表達水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05,見表2)。

表2 各組AtT-20細胞中MSP58 mRNA表達水平比較

2.3 各組AtT-20細胞增殖情況

各個時間點,NC-siRNA組與對照組AtT-20細胞增殖率相比,差異均無統計學意義(P>0.05)。與NC-siRNA組相比,MSP58-siRNA組AtT-20細胞增殖率顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05,見表3)。

表3 各組AtT-20細胞增殖率比較

2.4 各組AtT-20細胞侵襲情況

NC-siRNA組與對照組AtT-20細胞侵襲細胞數相比,差異無統計學意義(P>0.05)。與NC-siRNA組相比,MSP58-siRNA組AtT-20細胞侵襲細胞數顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05,見圖2、表4)。

圖2 各組AtT-20細胞侵襲情況

表4 各組AtT-20細胞侵襲細胞數比較

2.5 各組AtT-20細胞遷移情況

NC-siRNA組與對照組AtT-20細胞遷移細胞數相比,差異無統計學意義(P>0.05)。與NC-siRNA組相比,MSP58-siRNA組AtT-20細胞遷移細胞數顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05,見表5、圖3)。

表5 各組AtT-20細胞遷移細胞數比較

圖3 各組AtT-20細胞遷移情況

2.6 各組AtT-20細胞中MSP58、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達情況

NC-siRNA組與對照組AtT-20細胞中MSP58、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平相比,差異無統計學意義(P>0.05)。與NC-siRNA組相比,MSP58-siRNA組AtT-20細胞中MSP58、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05,見表6、圖4)。

表6 各組AtT-20細胞中MSP58、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平比較

3 討論

垂體瘤是一種發病率僅次于腦膜瘤、腦膠質瘤的顱內腫瘤,大部分為不會發生遠處轉移的非侵襲性垂體瘤,惡性程度較低[9]。然而,還有少部分垂體瘤為侵襲性垂體瘤,具備與惡性腫瘤類似的生長方式,可向鞍區周圍的垂體窩、鞍底骨質、海綿竇、蝶竇和下丘腦等部位侵襲,造成不同程度的破壞,生長速度快,治療難度大,復發性高[10,11]。因此,尋找在腫瘤生長、侵襲等惡性生物學行為中起重要作用的關鍵分子,并闡明其相關機制,對侵襲性垂體瘤治療具有重要價值。本研究在前期實驗中發現AtT-20細胞侵襲性較其他垂體瘤細胞系(HP75、GH3、GT1-1)強,故本研究僅針對AtT-20細胞的生物學行為展開實驗。

MSP58又稱為微球蛋白1(MCRS1),在目前研究中被認為是一種癌基因,在核糖體轉錄調節、細胞增殖、致癌轉化等多種細胞過程中起重要作用[12]。Yang等[13]認為,MSP58是與rRNA轉錄、細胞增殖相關的核仁蛋白,通過與各種轉錄因子的相互作用調節轉錄,在許多細胞生物學過程中發揮作用。尹戰海等[5]研究表明,MSP58基因在骨肉瘤腫瘤組織中過度表達,下調其表達可抑制骨肉瘤細胞增殖能力。張樹天等[8]研究表明,利用特異性siRNA下調MSP58基因的表達,能顯著抑制肺癌A549細胞的增殖、侵襲能力,認為MSP58有望成為肺癌治療的新靶點。Zhai等[14]研究發現,下調MSP58可能通過調節Wnt/β-catenin信號傳導途徑抑制了腎細胞癌細胞的增殖和侵襲。但Wang等[15]研究發現,MCRS1通過抑制端粒酶活性可抑制胃癌患者的淋巴轉移,過表達MCRS1可抑制胃癌SGC-7901細胞增殖,遷移,侵襲過程。垂體瘤細胞的增殖情況可從一定程度上反映腫瘤的惡性程度。本研究通過下調MSP58在AtT-20細胞中的表達發現,AtT-20細胞中MSP58下調表達后細胞增殖率顯著降低,提示MSP58參與AtT-20細胞增殖過程,可能通過干預AtT-20細胞增殖影響腫瘤惡性程度,下調其表達有助于降低腫瘤惡性,方便治療。

部分垂體瘤具有侵襲性,易導致患者治療后復發,這是神經外科亟待解決的難題,目前通常采用手術治療、藥物治療、放射治療等治療方式,但都有其局限性,深入了解腫瘤侵襲性生長機制,將有助于推動侵襲性垂體瘤的個體化、精準化治療[16,17]。本研究結果顯示,成功下調MSP58在AtT-20細胞中的表達后,AtT-20細胞侵襲、遷移細胞數顯著降低,提示MSP58表達與AtT-20細胞侵襲、遷移過程有關,針對MSP58表達進行治療可能有助于減少垂體瘤復發。PCNA是細胞增殖分裂所必需的蛋白之一,上調其表達可促進乳腺癌細胞增殖[18]。MMP-2、MMP-9均為MMP家族成員,可以降解許多細胞外基質成分,創造有利于腫瘤細胞發生侵襲、遷移的環境,在腫瘤侵襲、遷移過程中發揮重要作用[19,20]。本研究結果顯示,成功下調MSP58在AtT-20細胞中的表達后,AtT-20細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平均顯著降低,提示MSP58可影響AtT-20細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達,并可能通過影響上述蛋白表達,進而參與對AtT-20細胞增殖、侵襲、遷移的調控。

綜上所述,下調MSP58表達后,垂體瘤細胞AtT-20的增殖、侵襲、遷移過程均受到明顯抑制,MSP58可能成為垂體瘤治療的新靶點。