E3泛素連接酶TRIM50促進口腔鱗狀細胞癌增殖及遷移侵襲的分子機制研究

劉 琛,趙許兵,程 政,馬志軍

(1西安交通大學口腔醫學院口腔綜合科,西安 710004;2西安市第九醫院口腔科;*通訊作者,E-mail:Maazhijun@126.com)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常見的口腔頜面部惡性腫瘤,在口腔癌中占比90%,其發病率在全身腫瘤中排名第八[1]。盡管針對OSCC的放化療以及手術治療在不斷進步,但是患者的總生存率并沒有因此而得到明顯的提高[2,3]。因此,尋找可靠的生物標志物和新的分子靶點對為OSCC患者制定并實施精準的個性化的治療方案至關重要[4]。

泛素化是泛素與目標蛋白賴氨酸殘基發生共價結合使其降解的生物學過程,此過程由3種酶完成,泛素激活酶(E1)、泛素偶聯酶(E2)和泛素連接酶(E3),每一種酶都由一組蛋白組成[5]。其中E3連接酶是泛素級聯的關鍵組成部分,通過直接與各種底物相互作用,在泛素化途徑中發揮特殊作用[6,7]。目前,根據泛素蛋白酶體系統(ubiquitin proteasome system,UPS)的組成成分進而開發靶標藥物是腫瘤研究中的一個熱點,受到越來越多的關注[8]。TRIM(tripartite motif containing protein)蛋白家族近年來因其特有的結構(3個保守的結構域)和廣泛參與各種生物學途徑而備受關注[9]。越來越多的證據表明部分TRIM家族成員作為E3泛素連接酶介導泛素化降解途徑靶向調控癌相關基因,在癌癥發展的過程中起到關鍵作用[10]。

TRIM50作為TRIM蛋白家族新成員,參與調控神經系統的發育以及胃消化腺的分泌等過程[11,12]。但其在腫瘤方面的相關報道甚少,特別是在口腔癌中并沒有報道。本研究旨在探究E3泛素連接酶TRIM50對OSCC生物學功能的影響,并初步探究TRIM50蛋白表達對OSCC細胞惡性表型調控的潛在機制,為明晰OSCC發病機制以及發展分子靶向治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 OSCC細胞系SCC9、SCC25以及Cal27購于美國菌種保藏中心,HOK和HSC3細胞購于廣州賽庫生物公司。細胞完全培養基按DMEM培養基 ∶胎牛血清 ∶青鏈霉素=90 ∶9 ∶1的體積比例配制,細胞培養瓶放置在37 ℃、體積分數為5% CO2的恒溫培養箱中培養。當OSCC細胞生長至密度為約80%時,用0.25%的胰蛋白酶消化并傳代,收集生長狀態良好的細胞進行后續的細胞轉染、細胞增殖、克隆形成以及遷移侵襲等實驗。

1.2.2 過表達載體構建 過表達目的蛋白的載體為pcDNA3.1(+),由CMV啟動子驅動目的基因的表達。TRIM50-Flag cDNA克隆的上游引物序列為5′-GCGAAGCTTATGGCTTGGCAGGTGAGCCTG-3′,其5′端包含了保護堿基GCG以及HindⅢ限制性內切酶的酶切位點;其下游引物序列為5′-CGGGATCCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCAGCTTG-GTGGGCTGCTCGG-3′,其5′端包含了BamHⅠ限制性內切酶的酶切位點。Rb-HA cDNA克隆的上游引物序列為5′-GCGAAGCTTGCGGAAAGGCGTCA-TGCCGCC-3′,下游引物的序列為5′-CGGGATCCAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATTTC TCTTCCTTGTTTGAGGTATCC-3′。其上游及下游引物的5′端分別包含HindⅢ以及BamHⅠ酶切位點。Ub-Flag cDNA克隆上游引物序列為5′-GCGAAGC-TTATGCAGATCTTCGTGAAAACCC-3′,下游引物序列為5′-CGGGATCCCTTGTCATCGTCG TCCTTGTAGTCGCCACCCCTCAGGCGCAGG-3′。全長cDNA克隆PCR的反應條件為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸按每個千道爾頓1 min進行,循環33次。

1.2.3 細胞轉染 按1×105的數量將OSCC細胞接種于6孔板中。待細胞融合至密度約為60%時,按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書,轉染TRIM50 siRNAs以及上述過表達載體和空白載體pcDNA3.1(+)至OSCC細胞。轉染6 h后,更換新鮮培養基并繼續培養48 h,收集目的細胞用于后續實驗。本實驗所用干擾片段均由吉瑪基因公司(上海)設計并合成,具體序列見表1。

表1 干擾片段序列

1.2.4 采用蛋白質免疫印跡法檢測TRIM50和Rb蛋白表達量 收集轉染后的各組OSCC細胞,加入RIPA裂解液,置于冰上充分裂解30 min以提取細胞的總蛋白。用BCA蛋白試劑盒測定各組蛋白濃度后,取適量蛋白溶液,95 ℃加熱15 min使蛋白質變性。每泳道上樣20 μg蛋白,之后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(dodecyl sulfate sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳(100 V,90 min),將分離的蛋白通過半干轉法(100 V,45 min)轉移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF),轉膜后置于5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h,再分別加入抗TRIM50(ab272586,abcam,1 ∶1 000)、β-actin(BS6007M,Bioworld,1 ∶5 000)、Rb(ab24,abcam,1 ∶1 000)、Flag(M185-3L,MBL,1 ∶2 500)和HA(M180-3S,MBL,1 ∶2 000)抗體,4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的二抗(1 ∶1 000),37 ℃下孵育1 h。洗膜后,滴加增強化學發光液進行避光顯影。

1.2.5 采用逆轉錄聚合酶鏈反應法檢測TRIM50和Rb基因表達量 使用TRIzol裂解液裂解實驗細胞并提取總RNA,然后通過逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。再以cDNA為模板,通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒進行PCR擴增。TRIM50上游引物:5′-CGCCAAACTGGTGAACAAC-3′;下游引物:5′-TGGTCCTCATTGCCGAAC-3′。Rb上游引物:5′-AGTTCGCTTGTATTACCG-3′;下游引物:5′-ATTTCAATGGCTTCTGG-3′。內參基因GAPDH上游引物:5′-CAA-GGTCATCCATGACAACTTTG-3′;下游引物:5′-GT-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。擴增結束后,進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 采用細胞計數法檢測細胞增殖能力 用靶向TRIM50的siRNAs或過表達質粒轉染OSCC細胞(1×104)48 h后,將各組細胞接種于24孔培養板中培養。分別在細胞培養24,48,72,96,120 h后進行細胞計數,每次實驗重復3次,統計各組的細胞數,并繪制細胞生長曲線圖。

1.2.7 采用細胞克隆集落形成法檢測細胞克隆形成能力 同樣將所示的質?；騭iRNAs轉染至OSCC細胞48 h后,將其置于6孔培養板中,用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養14 d。之后用無水甲醇固定細胞,然后用結晶紫溶液染色。在顯微鏡下統計≥30 μm的細胞集落數,每次實驗重復3次。

1.2.8 采用Transwell法檢測細胞遷移侵襲能力 Transwell小室實驗用于體外細胞遷移和侵襲的測定,用siRNAs或是質粒轉染OSCC細胞。之后,將無血清培養基重懸1×104轉染后的細胞并接種到上室進行細胞遷移測定。對細胞侵襲的測定,我們在上室覆蓋基質膠再接種相應數量的轉染細胞。遷移和侵襲后的細胞用無水甲醇固定,通過5%結晶紫溶液染色。在顯微鏡下從每個下室膜中采集圖像,統計發生遷移侵襲的細胞數量。

1.2.9 采用免疫共沉淀法驗證TRIM50蛋白與Rb蛋白的相互作用 將TRIM50-Flag和Rb-HA過表達質粒轉染至HSC3細胞48 h,再用10 μmol/L MG132處理細胞6 h,然后使用抗Flag或HA抗體孵育轉染細胞的蛋白裂解液,4 ℃過夜,使其充分與目的蛋白結合,免疫復合物用蛋白A/G瓊脂糖珠進行捕獲,之后再通過SDS-PAGE電泳分離。然后對電泳后PAGE凝膠進行銀染質譜分析,或者通過蛋白質免疫印跡法檢測免疫共沉淀復合物中的蛋白。

1.2.10 采用放線菌酮實驗檢測Rb蛋白降解半衰期的變化 將TRIM50-Flag過表達質粒轉染至HSC3細胞,并設置空載組作為對照,轉染48 h后,提取細胞蛋白記為0 h,然后在培養基中加入20 μg/ml CHX,分別在加入2,4,6,8 h后提取細胞蛋白。之后,通過蛋白質免疫印跡法檢測CHX處理后的細胞內蛋白降解的情況。

1.2.11 采用體外泛素化實驗檢測Rb蛋白的泛素化水平 將TRIM50-Flag、Rb-HA以及Ub-Flag過表達質粒共轉染HSC3細胞48 h,MG132(10 μmol/L)處理6 h,使用抗HA抗體免疫沉淀Rb-HA蛋白免疫復合物,通過蛋白質免疫印跡法檢測Rb-HA蛋白的泛素化水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18統計學軟件處理分析實驗數據,實驗結果通過GraphPad Prism 5繪圖。所有實驗均獨立重復至少3次,兩組數據采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。當P<0.05時,視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TRIM50蛋白在不同的OSCC細胞系中的表達量

蛋白質印跡結果顯示,TRIM50蛋白的表達水平在SCC9和SCC25細胞中較低,在Cal27與HOK細胞中較高(見圖1)。

圖1 TRIM50蛋白在不同OSCC細胞系中的表達

2.2 過表達TRIM50促進OSCC細胞增殖能力

蛋白質印跡結果顯示,TRIM50-Flag-pcDNA3.1(+)轉染的SCC9以及SCC25細胞后成功過表達TRIM50蛋白(見圖2A)。與空白對照組相比,過表達TRIM50組OSCC細胞增殖活力明顯增強,差異具有統計學意義(P<0.01,見圖2B)。

圖2 過表達TRIM50對OSCC細胞的增殖能力的調控作用

2.3 過表達TRIM50促進OSCC細胞克隆形成能力

與空白對照組相比,過表達TRIM50組OSCC細胞的克隆形成集落數明顯增多,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖3)。

與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.4 過表達TRIM50促進OSCC細胞遷移侵襲能力

與空白對照組相比,過表達TRIM50組的OSCC細胞遷移侵襲的數量顯著升高(P<0.01,見圖4)。

與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.5 沉默TRIM50抑制OSCC細胞增殖能力

蛋白質印跡結果顯示,TRIM50 siRNA干擾片段轉染后的Cal27以及HOK細胞成功下調TRIM50蛋白的表達(見圖5A)。與陰性對照組相比,沉默TRIM50組OSCC細胞的生長能力顯著受到抑制(P<0.01,見圖5B)。

圖5 TRIM50沉默對OSCC細胞的增殖能力的影響

2.6 沉默TRIM50抑制OSCC細胞克隆形成能力

與陰性對照組相比,沉默TRIM50組OSCC細胞克隆形成能力顯著下調(P<0.01,見圖6)。

與陰性對照組比較,**P<0.01

2.7 沉默TRIM50抑制OSCC細胞遷移侵襲能力

與陰性對照組相比,沉默TRIM50組OSCC細胞遷移侵襲的能力受到顯著抑制(P<0.01,見圖7)。

與陰性對照組比較,**P<0.01

2.8 TRIM50與抑癌蛋白Rb相互作用

根據TRIM50蛋白免疫免疫共沉淀蛋白印跡法結果顯示,與空白對照組相比,過表達TRIM50組的Rb蛋白存在于TRIM50蛋白復合物中(見圖8A),過表達Rb組的TRIM50蛋白也存在于Rb蛋白復合物中(見圖8B),二者共沉淀。

圖8 TRIM50蛋白與抑癌蛋白Rb相互作用

2.9 TRIM50抑制Rb蛋白的表達

蛋白質印跡以及逆轉錄PCR結果顯示,與空白對照組相比,過表達TRIM50組Rb蛋白的表達水平下調,Rb mRNA的表達水平沒有變化(見圖9A)。與陰性對照組相比,而沉默TRIM50組Rb蛋白的表達量上調,Rb mRNA的表達沒有變化(見圖9B)。

圖9 TRIM50對Rb表達水平的調控

2.10 TRIM50促進Rb的泛素化降解從而下調Rb蛋白的表達

相比于空白對照,TRIM50過表達縮短了Rb蛋白降解的半衰期(P<0.05,見圖10A,B)。泛素化實驗結果顯示,在蛋白酶體抑制劑MG132存在時,相比于空白對照組,TRIM50過表達組Rb多聚泛素化水平增多(見圖10C)。

圖10 過表達TRIM50對Rb半衰期以及泛素化水平的影響

2.11 TRIM50表達逆轉Rb過表達對HSC3細胞增殖的抑制作用

蛋白質印跡結果顯示,TRIM50-Flag-pcDNA3.1(+)和Rb-HA-pcDNA3.1(+)共轉染的HSC細胞成功過表達Rb和TRIM50蛋白(見圖11A)。細胞生長實驗結果顯示,相比于Rb過表達組,TRIM50與Rb共過表達組HSC細胞增殖能力增強(P<0.01,見圖11B),但相比于空白對照組,TRIM50與Rb共過表達組HSC細胞增殖能力沒有變化(P>0.05,見圖11B)。

圖11 TRIM50表達逆轉Rb過表達對HSC3細胞增殖的抑制作用

2.12 TRIM50過表達逆轉Rb過表達對HSC3細胞克隆形成的抑制作用

細胞克隆形成實驗結果顯示,相比于Rb過表達組,TRIM50與Rb共過表達組的HSC3細胞克隆形成能力增強(P<0.01,見圖12);但相比于空白對照組,TRIM50與Rb共過表達組HSC3細胞克隆形成能力沒有明顯變化(P>0.05,見圖12)。

圖12 TRIM50過表達逆轉Rb過表達對HSC3細胞克隆形成的抑制作用

2.13 TRIM50過表達逆轉Rb過表達對HSC3細胞遷移侵襲的抑制作用

細胞遷移侵襲實驗結果顯示,相比于Rb過表達組,TRIM50與Rb共過表達組HSC3細胞遷移侵襲能力增強,差異具有統計學意義(P<0.01,見圖13);但相比于空白對照組,TRIM50與Rb共過表達組HSC3細胞遷移侵襲能力沒有變化(P>0.05,見圖13)。

與其余三組比較,**P<0.01

3 討論

根據腫瘤統計數據顯示,OSCC是頭頸部最常見的腫瘤之一,全球每年有超過30萬的新確診患者[13,14]。由于OSCC具有高侵襲性轉移生物學行為,即使是早期癌也容易出現淋巴結轉移,致死率較高[15]。同時,患者術后常有復發,預后不盡人意,其5年生存率基本保持不變[3]。因此,尋找新的關鍵靶點分子對OSCC治療具有重要意義。UPS負責降解細胞中80%-90%的已知蛋白[16,17]。人類UPS的特異性主要由大約617個E3泛素連接酶決定,參與細胞周期調控和腫瘤發生的一些蛋白(如p53、p27和cyclins)被E3連接酶酶特異性調控[18-20]。由此可見,E3泛素連接酶腫瘤發生發展中的發揮著重要作用。

TRIM50最初在Williams-Beuren綜合征中被鑒定為E3泛素連接酶[12]。另有報道表明,TRIM50與SNAIL相互作用,參與調控其降解抑制肝癌的發生發展[21]。到目前為止,有關TRIM50功能的報道非常有限,其生物學功能也遠未闡明。TRIM50在癌變中的作用并不是很明確,尤其是在OSCC中,鑒于E3連接酶在疾病中的活性,我們預計它可能參與調控OSCC的發展。在本研究中,我們在OSCC細胞中進行TRIM50過表達,并檢測細胞增殖、克隆形成、遷移侵襲等功能的變化。結果發現,過表達TRIM50能夠增強OSCC細胞的增殖、克隆形成以及遷移侵襲能力。另外,TRIM50沉默后相關的功能實驗結果顯示,沉默TRIM50抑制了OSCC細胞的增殖、克隆形成以及遷移侵襲能力。因此,綜合TRIM50過表達和沉默兩方面的功能實驗結果表明,E3泛素化連接酶TRIM50在OSCC惡性表型維持中呈現出正向調控的功能,我們首次證明了TRIM50作為一個促癌基因調控OSCC的發生發展。

為了深入研究TRIM50促進OSCC細胞增殖和轉移的分子機制,我們通過免疫共沉淀和質譜分析的方法來鑒定與其相互作用的蛋白,以發現E3連接酶TRIM50作用的底物。根據質譜分析的結果,我們通過免疫共沉淀蛋白印跡法證實,TRIM50蛋白與Rb蛋白相互作用,說明Rb蛋白可能是E3連接酶TRIM50的潛在底物。眾所周知,視網膜母細胞瘤腫瘤抑制蛋白Rb是細胞生長周期和的關鍵調節因子,調控相關基因的轉錄和表達從而導致細胞周期在G1期停滯[22]。為了進一步明確TRIM50與Rb的關系,我們探究了TRIM50的表達對Rb mRNA、蛋白表達水平的影響。結果發現,TRIM50負向調控Rb蛋白的表達量卻不影響其mRNA的表達水平,說明TRIM50在轉錄后水平負向調控Rb蛋白的表達。因為TRIM50是E3泛素連接酶,因此我們推測TRIM50可能是通過促進了Rb的泛素化降解從而抑制OSCC細胞中的Rb蛋白的表達。為了確定TRIM50是否與Rb的泛素化降解有關,我們進一步研究了TRIM50對Rb蛋白半衰期和泛素化的影響。放線菌酮實驗結果顯示,TRIM50過表達縮短了Rb蛋白降解的半衰期。泛素化實驗結果顯示,過表達TRIM50增加了Rb蛋白多聚泛素化的水平。綜上所述,我們的結果表明了TRIM50通過促進Rb的泛素化降解從而下調OSCC細胞中的Rb蛋白的表達量。為了證實TRIM50通過調控Rb蛋白的表達量從而抑制OSCC細胞的增殖和轉移,我們進行了TRIM50和Rb共表達組合功能實驗,結果發現,過表達TRIM50能逆轉過表達Rb對OSCC細胞惡性生物學功能的抑制作用。因此可以說明,Rb是TRIM50下游的靶標分子,被其所介導的泛素化降解途徑所調控,從而影響OSCC的生物學功能,我們初步闡明了TRIM50促進OSCC的增殖和轉移的分子機制。

綜上所述,我們揭示了TRIM50與OSCC細胞增殖與轉移之間的關系,發現E3泛素化連接酶TRIM50在OSCC中作為一個腫瘤驅動因子調控細胞的惡性表型,從而促進了OSCC的發生發展。TRIM50通過促進OSCC細胞中抑癌蛋白Rb的泛素化和降解來間接促進其激進的生物學行為。因此,靶向TRIM50-Rb通路可能是治療OSCC的有效手段。