黃芩、大黃、黃連治療牙周炎癥復方配伍的體外篩選

谷冬華,郭 寧,劉 瑾,趙曉丹,李 昂,茍建重

(陜西省顱頜面精準醫學研究重點實驗室,西安交通大學口腔醫院牙周黏膜病科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:liujin8511@163.com)

牙周炎是由菌斑微生物引起的一種慢性感染性疾病,主要表現為牙齦炎癥、牙周袋形成、牙槽骨吸收和牙齒松動脫落。人牙周膜細胞(HPDLCs)作為牙周再生的主要細胞[1],在牙周炎病損部位其數量和功能會受到一定的限制。菌斑微生物中革蘭氏陰性細菌細胞壁外壁的組成成分為脂多糖(LPS),當細菌死亡時它會通過溶解、破壞細胞結構并刺激其產生大量的炎性細胞因子[2],而這些炎性細胞因子又會進一步破壞牙周組織,促進結締組織和骨組織吸收,加重牙周炎癥狀態。因此牙周炎的治療需要在控制炎癥的基礎上,同時達到有效抑制細菌、調節宿主防御能力的功效。目前,中藥制劑局部應用已成為藥物治療牙周炎的研究熱點之一,而提取中藥有效部位和有效成分并進行配伍的復方研究是中藥制劑的發展趨勢[3]。研究表明中藥黃芩的有效提取成分黃芩素具有抗菌、抗炎、抗病毒及調節免疫等功效[4];大黃的有效成分大黃素具有瀉火、抗菌、消炎和成骨等功效[5];黃連的有效成分鹽酸小檗堿,具有抗微生物、抗腫瘤、降血糖以及在心腦血管系統和血液系統方面的作用[6],因此大黃、黃芩、黃連在牙周病的防治方面有很大的研究價值[7-9],但這3種中藥有效成分如何配伍才能起到增效減毒的作用尚無研究。前列腺素E2(PGE2)是人體免疫反應過程中產生的炎性因子,可介導牙周結締組織和骨組織的破壞。在牙周炎病理過程中,炎性牙齦和齦溝液中的PGE2顯著增加,同時PGE2也可以促進破骨細胞的形成[10]。因此通過檢測出人牙周膜細胞產生PGE2的含量能有效反映出牙周的炎癥情況。本研究是將3種中藥有效部位配伍復方聯合作用于LPS刺激之下的人牙周膜細胞中,通過檢測細胞產生PGE2的濃度,篩選出具有增效減毒效應的配伍復方,為中藥治療牙周炎提供進一步實驗依據。

1 儀器和材料

1.1 儀器

LC-2010高效液相色譜儀(日本島津),ESJ120-4電子天平(沈陽龍騰電子有限公司),SB-5200型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司),KDC-16H高速離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司),TL-40B低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠),78HW-1恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機廠),Costa 96孔培養板(U.S.A),SHH.W21-600B三用電熱恒溫水箱(北京長風儀器儀表公司),滅菌手術器械(手術刀、眼科剪和眼科鑷等),滅菌培養瓶和培養皿,吸管,移液管,離心管等。以上器械均由西安交通大學口腔醫院中心實驗室提供。

1.2 材料

中藥黃芩、大黃、黃連(購自老百姓大藥房,經過西安醫科大學藥房鑒定),黃芩素對照品(中國藥品生物制品鑒定所,批號:11595-200905),大黃素對照品(中國藥品生物制品鑒定所,批號:110756-200110),鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品鑒定所,批號:110713-200208),色譜甲醇(Honeywell Burdick&Jackson,USA),脂多糖(LPS,Sigma),PGE2ELISA kit(R&D)。

2 實驗方法

2.1 黃芩、大黃、黃連有效部位的提取與有效成分濃度測定

采用有機溶劑超聲萃取的方法提取黃芩乙醚部位、大黃乙醚部位和黃連水部位,并使用高效液相色譜法(HPLC)測定其中的黃芩素、大黃素和鹽酸小檗堿的含量。

2.1.1 黃芩、大黃、黃連有效部位的提取 使用電子天平分別精確稱取50 g黃連藥物放入1 000 ml燒杯中,加入200 ml甲醇水溶液(甲醇的體積分數為70%),混合后,保鮮膜封口,超聲30 min,手機上清液,重復3次。將收集得到的上清液1 000 r/min離心,棄去底部沉淀,過濾,測量濾液體積。使用旋轉蒸發儀將大部分液體揮去,使用甲醇的萃取物成浸膏后,移入10 ml離心管內進行旋轉蒸干,得黃連萃取物。加入雙蒸水(按照20 ml濾液中加入10 ml雙蒸水比例),使粗提物充分溶解后,加入與雙蒸水等體積的石油醚,混勻,超聲30 min,棄上清液,重復3次。將此剩余物加入與雙蒸水等體積的乙醚混勻,超聲30 min,棄上清液,重復3次。再將剩余物中加入與雙蒸水等體積的氯仿,混勻,超聲30 min,棄去下層液體,重復3次,剩余物即為黃連水部位,旋轉蒸干,置陰涼處干燥保存備用。

黃芩、大黃乙醚部位提取方法,同黃連水部位加入石油醚前的操作步驟,再將石油醚萃取后的剩余物中,加入與石油醚等體積的乙醚,超聲萃取30 min,收集上清液,揮干,即得到黃芩和大黃乙醚部位,置陰涼干燥處保存備用。

2.1.2 黃芩、大黃、黃連有效成分濃度測定 色譜條件:色譜柱Chromolith C18(50 mm×4.6 mm,20 μm,Merck)。流動相:黃芩素為甲醇(A)-0.4%冰醋酸+0.2%三乙胺(B)(V∶V=50 ∶50);大黃素為甲醇(A)-0.1%冰醋酸(B)(V∶V=80 ∶20);鹽酸小檗堿為乙腈(A)-水(B)(V∶V=28 ∶72)。梯度洗脫條件為0-2 min,20%A;2-10 min,20%-65%A;10-12 min,65%A;12-14 min,65%-20%A。檢測波長為黃芩素254 nm,大黃素254 nm,鹽酸小檗堿360 nm。柱溫為28-30 ℃。體積流量為0.2 ml/min。進樣體積為5 μl。

有效濃度測定:稱取各對照品1 mg,色譜甲醇溶解并定容至5 ml,得對照品原液,采用梯度稀釋法獲得 100,80,60,40,20 μg/ml系列濃度的對照品儲備液。精確稱取各樣品1 mg,色譜甲醇溶解并定容至5 ml,高效液相色譜法測定其中的黃芩素、大黃素和鹽酸小檗堿的含量。

2.2 中藥有效部位對LPS刺激人牙周膜細胞產生PGE2的影響

2.2.1 HPDLCS的培養和鑒定 選取西安交通大學口腔醫院頜面外科門診年齡為12-20歲青少年因正畸治療拔除的健康前磨牙及第三磨牙。牙齒拔除后直接置于無菌D-Hanks液中反復沖洗操作后轉移到盛有DMEM培養液的培養皿中,刮取根中1/3處的牙周膜組織,剪碎(約1 mm×1 mm×1 mm)培養和傳代,選取3-5代細胞進行后續實驗。本研究經西安交通大學口腔醫院倫理委員會批準,事先告知患者并簽署知情同意書。

2.2.2 酶聯免疫吸附實驗(ELISA法)測定黃芩、大黃、鹽酸小柴堿對LPS刺激HPDLCs產生PGE2的影響 取對數生長期的第6代人牙周膜細胞,用0.25%胰酶消化后用含10%FBS的DMEM培養基配制成細胞懸液,按照4×104個細胞/ml的密度,每孔接種200 μl接種于96孔板,置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養過夜。在細胞鋪滿80%時,吸去上清液分別加入32組藥物+1 μg/ml LPS 200 μl,同時設空白對照組(只加入DMEM培養基)和LPS組(只加入1 μg/ml LPS),每組設3個復孔,37 ℃下培養72 h。酶聯免疫吸附實驗(ELISA法)測定大黃、黃芩、黃連有效部位對HPDLCs產生PGE2含量的影響。

2.3 統計學分析

3 結果

3.1 黃芩、大黃、黃連有效成分濃度測定

3.1.1 大黃乙醚部位中大黃素含量的測定 按照色譜條件測得大黃素的保留時間為7.9 min,得出大黃素對照品濃度分別為60,40,20,10,1 μg/ml時的色譜圖及大黃素乙醚部位色譜圖(見圖1A),并根據各濃度時的大黃素保留峰面積,采用標準曲線法得出大黃素標準曲線為:y=62 008x-49 745,R2=0.995 4,按照標準曲線通過濃度換算,得出大黃素在大黃乙醚部位中含量為7.50%。

3.1.2 黃芩乙醚部位中黃芩素含量的測定 按照色譜條件測得黃芩素的保留時間為14 min,得出黃芩素對照品濃度分別為100,80,60,40,20 μg/ml時的色譜圖及黃芩乙醚部位色譜圖(見圖1B),并根據各濃度時的黃芩素保留峰面積,采用標準曲線法得出黃芩素標準曲線為:y=130 253x-106,R2=0.993 0,按照標準曲線通過濃度換算,得出黃芩素在黃芩乙醚部位中含量為19.94%。

3.1.3 黃連水部位中鹽酸小檗堿含量的測定 按照色譜條件測得鹽酸小檗堿的保留時間為7.9 min,得出鹽酸小檗堿對照品濃度分別為100,80,60,40,20 μg/ml時的色譜圖及黃連水部位的色譜圖(見圖1C),并根據各濃度時的鹽酸小檗堿保留峰面積,采用標準曲線法得出鹽酸小檗堿標準曲線為:y=8 486.1x-9 099.6,R2=0.998 5,按照標準曲線通過濃度換算,得出鹽酸小檗堿在黃連水部位中含量為80.87%。

圖1 大黃、黃芩、黃連水活性部位通過HPLC的色譜圖

3.2 HPDLCs原代培養及鑒定

HPDLCs細胞爬片經HE染色后,在光鏡下觀察可見細胞呈長梭形或呈多角形,數個突起,胞漿紅染,單核,胞核呈藍紫色,圓形或橢圓形,居中,2-3個核仁,細胞排列呈柵欄狀、旋渦狀、放射狀(見圖2A)。細胞爬片經免疫組化染色后,在光鏡下觀察,波形蛋白染色后,細胞胞漿呈棕黃色著色(見圖2B),角蛋白染色細胞漿無著色(見圖2C)。證明所培養的細胞是外胚層間充質來源,而非上皮來源。綜上所述,所培養細胞為人牙周膜細胞。

圖2 PDLCs細胞HE染色和免疫組化染色(×200)

3.3 黃芩、大黃、黃連有效部位配伍對LPS刺激下人牙周膜細胞產生PGE2的影響

經過前期實驗[11,12],得出黃芩素,大黃素,鹽酸小檗堿對人牙周膜細胞增殖活性的影響,得出最有效濃度分別為1.0,0.1,0.1 mg/L。根據測得的大黃乙醚部位,黃芩乙醚部位和黃連水部位中黃芩素、大黃素和鹽酸小檗堿含量分別為19.94%,7.5%,80.87%,得到以黃芩素含量計量黃芩乙醚部位的濃度為5 mg/L,以大黃素含量計量大黃乙醚部位的濃度為1.3 mg/L,以鹽酸小檗堿含量計量黃連水部位的濃度為0.12 mg/L,將此濃度分別按照×10倍和×0.1倍,再加上0 mg/L,組成每種藥物有效部位的4個濃度,借鑒L32(4)9正交表進行實驗分組。

將表1中每種中藥的4個不同濃度分別與其他兩種中藥的不同濃度相配伍,得出32組不同濃度配伍組并加入1 μg/ml的LPS 200 ml,與空白組(DEME培養基組)、LPS組對照得出人牙周膜細胞細胞產生PGE2的濃度,結果見表2。

表1 大黃、黃芩、黃連有效部位配伍不同濃度 (mg/L)

表2 大黃、黃芩、黃連有效部位配伍組對LPS刺激下人牙周膜細胞產生PGE2的影響

為進一步控制選擇偏倚,將表2中32個實驗組平均分成4組。1-8為組1,9-16為組2,17-24為組3,25-32為組4。采用t檢驗,組1、組2、組3、組4的PGE2濃度均高于空白對照組,且差異具有統計學意義(P<0.05,見表3)。組1、組2、組3、組4的PGE2濃度均低于只加LPS刺激組,且差異具有統計學意義(P<0.05,見表3)。這說明每組中至少有1組實驗的藥物配伍能夠有效減少LPS刺激下人牙周膜細胞產生PGE2的含量,隨后選取每組PGE2減少比例最高的樣本為進一步尋找有效配伍提供依據。從表2的32個實驗組中篩選出的有效濃度的5個配伍組,結果見表4,為后續體內動物實驗提供體外實驗依據。

表3 四組藥物配伍與兩種對照組PGE2的比較

表4 五個對人牙周膜細胞產生PGE2效果明顯的配伍組

4 討論

本實驗所選用的3種中藥,即黃芩、大黃、黃連,三者具有相似的理化特性及抗菌、抗炎作用,并均被證實且廣泛應用于臨床治療?；诖?如何提取這3種中藥的有效部位并進行復方配伍,測定其中的有效濃度,是將其運用于臨床治療的重要前提。中藥有效部位源自中藥或復方中藥提取物,它是其中某些含量達到總提取物的50%以上的化學成分混合體。以此種提取物制成的中藥新藥即為有效部位新藥。此外,尚有活性較強的活性成分在有效部位中含量很低,但是作用卻很強。因此單純根據藥物的含量多來定義有效部位不是很科學的[13]。本研究使用HPLC技術,采用標準曲線法對黃芩乙醚部位、大黃乙醚部位和黃連水部位中相應的黃芩素、大黃素和鹽酸小檗堿進行濃度測定,并以其作為各有效部位的質量控制指標。然后應用最適濃度稀釋和濃縮原理,確定各部位的4個濃度,進而配伍組成32組,這樣進一步將有效濃度進行細化分組,為細胞實驗提供基礎藥物環境。

前列腺素E2(PGE2)作為一種重要的細胞生長和調節因子,具有廣泛的致炎效應,如誘導血管擴張、增加毛細血管通透性,并與其他的炎癥介質(IL-1,TNF-α)有協同作用。PGE2介導骨吸收的最初證據是Klein等[14]1970年報道的。在牙周膜中產生PGE2的主要細胞是牙齦成纖維細胞和牙周膜細胞。并且有研究已證實牙周炎的骨破壞與高水平的PGE2密切相關[15]。通過本次實驗初步研究,在確定3種中藥各自有效濃度后,我們發現有5組配伍即5 mg/L黃芩乙醚部位和0.12 mg/L黃連水部位配伍,13 mg/L大黃乙醚部位和0.01 mg/L黃連水部位配伍,13 mg/L大黃乙醚部位和0.50 mg/L黃芩乙醚部位配伍,13 mg/L大黃乙醚部位和5 mg/L黃岑乙醚部位配伍,單一藥物50mg/L黃岑乙醚部位。這5組配伍可明顯檢測出有效減少的因LPS刺激下人牙周膜細胞中PGE2的濃度,并且對抑制PGE2的炎性具有明顯表達,減輕因炎癥刺激而產生的牙齦組織充血和骨組織吸收等不良反應有積極作用。實驗結果均為黃芩、大黃、黃連3味中藥中2味藥或者單味藥的效果較好,因為這3種中藥的藥物濃度設置是在前期藥物活性篩選并且各自促進細胞增殖的基礎上確定的,但是并不能說明單味藥物的最適濃度就是復方配伍藥物的最適宜濃度,后續實驗我們會根據結果進行更多濃度的篩選。本次實驗結果中顯示,單一藥物黃芩在濃度為50 mg/L的黃芩乙醚表現出有效減少因LPS刺激下人牙周膜細胞中PGE2的濃度明顯,PGE2的減少比例為45.66%,而在其他濃度中未見明顯的濃度變化,這表明單一藥物在不同濃度下的藥效特性。黃芩素是黃芩的最主要的活性成分之一,它通常被用作黃芩及其制劑的質量控制指標。黃芩素可通過抑制淋巴細胞的功能和炎癥介質的產生發揮抗炎作用[16]。黃芩素鎮痛作用的機制主要是調節炎性疼痛潛在的靶點脂氧合酶[17]。黃芩素也可通過減少來自與巨噬細胞的一氧化氮(nitric oxide,NO),對促炎癥基因的表達進行,從而抑制LPS刺激下,巨噬細胞內NO的產生以及誘導型一氧化碳合酶mRNA和蛋白質的表達,而這種抑制作用具有劑量依賴性[18]。與本次實驗結果相符合。

另外,在此次實驗中復方配伍對中13 mg/L大黃乙醚部位和5 mg/L黃芩乙醚部位配伍這一組配伍在有效減少的因LPS刺激下人牙周膜細胞中PGE2的濃度中效果最好,PGE2的減少比例為51.45%,明顯優于其他3組配伍對。分析其成分發現,中藥大黃的主要有效單體為大黃素(emodin)主要來源于蓼科植物的干燥根莖和根,是一種蒽醌類衍生物。劉冰等[19]通過研究大黃素對實驗性牙周炎模型牙齦組織及外周血中的NO含量的變化,得出大黃素可以通過降低牙周炎大鼠牙齦及外周血中NO的含量,而對牙周炎有一定的治療作用。而本次實驗中可發現有效配伍對中含有大黃乙醚的共計3組,且濃度均為13 mg/L,這也進一步提示此濃度可能是大黃乙醚中大黃素發揮藥效的有效濃度。

在這5組有效藥物濃度的配伍組中,4組復方配伍對和1組單一配伍相比較下,單一配伍組在有效減少的因LPS刺激下人牙周膜細胞中PGE2的濃度中效果略優于5 mg/L黃芩乙醚部位和0.12 mg/L黃連水部位配伍,13 mg/L大黃乙醚部位和0.012 mg/L黃連水部位配伍,13 mg/L大黃乙醚部位和0.50 mg/L黃芩乙醚部位配伍,而較差于13 mg/L大黃乙醚部位和5 mg/L黃芩乙醚部位配伍這一組效果。這樣的結果并不能完全說明復方配伍對的效果優于單一配伍對,針對每種中藥還需進一步證實其核心成分的細胞學及藥理學實驗結果。

綜上所述,是通過體外細胞實驗,將3種藥效相似的中藥黃芩、大黃、黃連進行有效部位的配伍組合,選擇采用體外分離人牙周膜細胞作為實驗對象,測定加入LPS刺激下PGE2的濃度,進一步篩選出來有效濃度配伍復方。并且,采用體外細胞實驗可以有效并精準地控制炎癥的水平,排除因炎癥部位人牙周膜細胞已出現受損,無法準確檢測出受損情況初期及末期PGE2濃度變化的偏倚,測定已知炎癥水平下PGE2的濃度,這一步對于日后牙周炎初期患者臨床用具體藥具有十分重要的指導意義。