玻璃膜疣主要成分膽固醇對人視網膜色素上皮細胞 金屬硫蛋白表達的影響

張敏，張鵬，趙洪禮,3

(1.沈陽大學生命科學與工程學院，城市有害生物治理與生態安全遼寧省重點實驗室，沈陽 110044；2.遼寧何氏醫學院基礎醫學院，沈陽 110163；3.沈陽百發科技有限公司，沈陽 110163)

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是廣泛存在于動植物和微生物組織中的一類能螯合大量金屬離子的小分子蛋白質，具有極強的清除活性氧與抗氧化能力，在體內主要具有參與微量元素代謝、重金屬解毒、清除羥基自由基、拮抗電離輻射及參與機體應激反應、增強機體對抗不良狀態的適應能力等多種作用[1-3]。MT可在眼睛中大量表達[4-5]。MTs(特別是MT-1，MT-2，MT-3)的積累是視網膜變性疾病的重要保護機制，如年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)和視網膜色素變性[6-7]。氧化應激和/或鋅毒性是這些疾病的一種共同途徑[6]。作為抗氧化劑，MT可在防御視網膜色素上皮細胞氧化損傷和細胞凋亡中發揮重要作用，如可保護視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)免于光輻射損傷[8-14]。研究MTs的表達模式和功能可以拓寬對這些疾病引發的內源性分子響應的理解，并有助于開發新的治療策略[6,12,15]。

目前AMD的發病機制尚不清楚，可能是氧化應激、炎癥、基因和環境等多因素相互作用的結果[16]。AMD可分為干性(地圖萎縮樣，85%～90%)和濕性(脈絡膜新生血管，10%～15%)兩種。玻璃膜疣是干性AMD的主要特征，是其最早期的眼底表現，與AMD的進展密切相關[16-17]。研究[17-19]表明：玻璃膜疣形成起始階段為在RPE下層以含膽固醇的脂滴為核心，微小羥基磷灰石球粒沉積，而其外層被Aβ、玻連蛋白、補體因子H等蛋白質包被覆蓋。有學者[18-19]在實驗室培養過程中重建了僅依賴于RPE細胞的玻璃膜疣生物發生過程，表明了RPE細胞可能是細胞外玻璃膜疣形成的起始和調控關鍵位置。所以RPE功能異?？赡芗仁遣Ａゐ嘈纬珊髮PE影響的結果，也可能是玻璃膜疣形成的主要因素。本研究利用玻璃膜疣形成起始階段的主要成分膽固醇培養人RPE細胞，分析RPE細胞中金屬硫蛋白轉錄水平和蛋白水平表達上的變化，初步探索人RPE細胞金屬硫蛋白與玻璃膜疣形成的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

人視網膜色素上皮細胞體外培養ARPE-19細胞株購自北納生物(細胞系)；膽固醇(≥99%)購自美國Sigma公司；總金屬硫蛋白抗體購自美國Proteintech公司；熒光染料使用美國Roche公司的light cycler 480 SYBR Green I Master。

1.2 人視網膜色素上皮細胞ARPE-19 細胞培養

將ARPE-19細胞系解凍離心后接種于含體積分數10%胎牛血清的DMEM/F12 培養液中，置于37 ℃、體積分數為5% CO2培養箱中培養。生長至大部分細胞接近融合狀態時使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。第3～5代細胞用于后續實驗。

1.3 ARPE-19 細胞培養處理

設置正常對照組：正常培養，分別取培養0，6，12，24，48，72 h不同細胞周期的ARPE-19細胞離心取細胞，液氮速凍后做好標記?80 ℃保存。

膽固醇處理組：以膽固醇濃度2.5 mg/mL培養(血液中的膽固醇濃度大約是200 mg/dL左右，也就是2 mg/mL)，分別在培養不同時間點0，6，12，24，48，72 h取細胞樣，PBS緩沖液漂洗3次后，液氮速凍做好標記?80 ℃保存。

不同處理組光學顯微鏡下觀察取圖，記錄好培養過程中細胞變化。

1.4 實時定量PCR 檢測轉錄水平的變化

吸去細胞原培養液，PBS 洗1 次，用胰酶消化細胞，1000 r/min離心5 min，PBS重懸細胞，1000 r/min離心5 min棄上清。采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit進行RNA提取，以gDNA Eraser與RNA溶液混合在42 ℃共浴2 min去除基因組DNA，之后反轉錄試劑盒反轉錄獲得mRNA。采用熒光定量PCR(quantitative real time-PCR，qRT-PCR)技術檢測mRNA轉錄表達水平變化，以Tubulin為內參，利用SYBR Green I熒光染料反應、循環數Ct 值法在ABI熒光實時定量PCR儀上檢測分析。內參Tubulin和3個金屬硫蛋白基因hMT1a，hMT2a，hMT3的引物序列見表1。

1.5 蛋白質印跡法檢測

提取細胞總蛋白，以BCA試劑盒檢測總蛋白含量。以SDS-PAGE電泳分離蛋白質，轉PVDF模后一抗和二抗孵育，以蛋白質印跡法比較不同處理下的蛋白表達量變化。凝膠系統觀察取圖，以Tubulin蛋白為標準參照，用Image J軟件對圖片結果進行灰度掃描分析。

2 結果

2.1 膽固醇對RPE細胞金屬硫蛋白轉錄水平表達的影響

通過實時定量PCR檢測正常培養對照組和加入玻璃膜疣主要成分膽固醇(2.5 mg/mL)處理0，6，12，24，48，72 h不同時間段ARPE-19細胞中三個金屬硫蛋白hMT1a，hMT2a，hMT3轉錄水平的表達情況。結果表明：在正常培養條件下，隨著時間延長，hMT1a，hMT2a，hMT3 mRNA表達略有變化，但變化不明顯，差異不具有統計學意義(P＞0.05，圖1)。加入膽固醇培養后，與對照組相比，隨著時間延長，hMT1a，hMT2a，hMT3 mRNA表達都呈現上調的趨勢，都是在12 h明顯增高，在24 h增高達到頂峰，48 h mRNA表達低于24 h但也是上調，在72 h時其表達略低于對照組但變化不顯著。其中hMT1a轉錄水平最高上調了4.9倍，hMT2a轉錄水平最高上調了17倍，hMT3轉錄水平最高上調了35倍。這些結果表明膽固醇處理下以hMT1a，hMT2a，hMT3為代表的金屬硫蛋白轉錄水平表達上調，并且hMT3的變化最大。

2.2 膽固醇對RPE 細胞金屬硫蛋白蛋白水平表達的影響

通過蛋白質印跡法檢測正常培養和2.5 mg/mL膽固醇處理0，6，12，24，48，72 h不同培養時間ARPE-19細胞中總金屬硫蛋白的蛋白表達情況(圖2)。結果表明：在正常培養時隨培養時間延長金屬硫蛋白表達略有增多，膽固醇處理24 h后金屬硫蛋白含量明顯增多(圖2A)。為定量比較兩組蛋白表達的變化，對蛋白質印跡法結果進行了灰度分析。對照組金屬硫蛋白的蛋白含量變化無明顯趨勢，到12 h略有降低，繼續培養到48 h含量增多，之后在72 h出現回落。加入膽固醇培養的ARPE-19細胞中金屬硫蛋白的蛋白含量隨時間延長不斷增多，在24 h開始增多，48 h和72 h時增加倍數最大，最高增多了約4倍(圖2B)。與轉錄水平相比，膽固醇處理組MT蛋白水平表達增多時間上略有延遲。mRNA水平是從12 h開始上調，到24 h水平最高，在48 h開始回落(圖1)。這些結果表明：膽固醇處理下金屬硫蛋白的蛋白表達水平明顯上調。

圖1 膽固醇對(A) hMT1a，(B) hMT2a，(C) hMT33個基因mRNA表達水平的影響Figure 1 The effect of cholesterol treatment on the mRNA expression levels of the three genes (A) hMT1a,(B) hMT2a,(C) hMT3

圖2 蛋白質印跡法檢測膽固醇對總金屬硫蛋白表達水平的影響Figure 2 Western blot detection of the effect of cholesterol treatment on the protein expression levels of total metallothionein

3 討論

雖然MT在疾病發生的機制方面有待深入，但其在研究疾病研究中所顯現出來的重要作用得到了許多科研工作者的重視[2-3]。MT結合金屬離子及清除氧自由基的功能使其在抗衰老、氧化應激及細胞凋亡等過程中發揮重要作用[1-3,12]。MT在許多疾病中的表達上調或下調可以作為疾病檢測的標志蛋白，或者可能成為新的治療方法的靶點[6,20]。在大鼠眼部組織中，MT可明顯表達于角膜上皮細胞、晶狀體、視網膜色素上皮層、視神經膠質細胞等，在神經纖維層也見表達[4]。在AMD患者的RPE細胞中檢測到MT的表達，并且過量表達MT3可能誘導血管內皮生長因子的表達來抑制激光誘導的小鼠脈絡膜新生血管的進程[5,20]。因此視網膜色素上皮細胞中MT的檢測可能有利于AMD的早期發現、早期診斷及早期治療。但是目前對于MT與AMD特別是干性AMD發展進程的關系尚不清楚。

在本研究中，以干性AMD的標志物玻璃膜疣形成起始階段的主要成分膽固醇作用于RPE細胞，檢測金屬硫蛋白轉錄和蛋白表達水平的變化，發現膽固醇暴露使hMT1a，hMT2a，hMT3的mRNA表達上調，其中hMT3的表達上調倍數最大。在蛋白水平上，總金屬硫蛋白表達量明顯增多。這些結果表明RPE細胞金屬硫蛋白可能受到玻璃膜疣形成起始階段脂質積累的刺激，特別是hMT3。金屬硫蛋白家族主要有4種類型，其中MT1和MT2在所有組織大量表達，MT3主要在神經系統包括視網膜中表達，MT4在皮膚上皮細胞中特異表達[1-2,4]。在小鼠中，MT3在RPE中的表達水平可能低于MT1a和MT2a[12]。但與MT1/MT2缺失相比，MT3缺失加劇了光暴露下小鼠視網膜細胞損傷和活性氧產生，表明MT3可能比MT1/MT2在視網膜中發揮了更大作用[13]。而在本研究中受膽固醇刺激，金屬硫蛋白表達量明顯增多，但其中hMT3變化最明顯，表明相比于hMT1a和hMT2a可能hMT3與玻璃膜疣形成起始階段關系更加密切，值得深入探討。

AMD早期最顯著的特征是眼底黃斑玻璃膜疣，對早期AMD患者，觀察黃斑區玻璃疣的特征及發展，對AMD的早期診斷和預后具有重要價值[16]。金屬硫蛋白可在玻璃膜疣形成初期出現表達上的變化，表明其可能與玻璃膜疣的發生發展密切相關，可能成為早期AMD中玻璃膜疣生物發生新的標志物。但金屬硫蛋白是否可作為AMD的早期檢測的標志物或影響玻璃膜疣形成進程尚需進一步探討。