精養池模式下不同生長速度花鰻鱺的腸道菌群比較研究

王 悅 趙盼月 陳學豪，2 翟少偉，2*

（1.集美大學水產學院，鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心，福建廈門361021；2.福建省水產生物育種與健康養殖工程研究中心，福建廈門361021）

花鰻鱺（Anguilla marmorata）是屬于鰻鱺目（An?guilliformes）、鰻鱺科（Anguillidae）的降海洄游性魚類，在全球的熱帶、亞熱帶西太平洋和印度洋海域均有廣泛分布，在我國主要分布于東南沿海及臺灣省[1-2]。近年來由于日本鰻鱺（Anguilla japonica）和歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）鰻苗的過度捕撈和環境問題導致天然捕撈量逐漸減少，價格急劇攀升[1，3]。而花鰻鱺在世界范圍分布較廣，其鰻苗價格較為便宜，在我國東南部地區具有一定的養殖規模[1,4]。

腸道是魚類消化飼料和營養物質吸收的主要部位，具有特殊的微生物群，腸道菌群對魚類的生長和健康起著重要作用，其組成與魚體生長速度密切相關，生長速度快的個體可能擁有更多的腸道益生菌[5-8]。通過比較不同生長速度的魚類腸道菌群的組成，可為腸道原籍益生菌的篩選提供參考。研究表明，原籍益生菌比一般的益生菌更容易在魚類的腸道內定植，在維持腸道健康，包括促進宿主的生長，產生消化酶和必需營養素，抵抗病原體的感染，刺激先天免疫系統等方面的作用更強[8-9]?；狑~在實驗室循環水養殖條件下的快速生長個體腸道內擁有更多的益生菌[6]，而其在實際生產條件下不同生長速度個體間的腸道微生物差異情況還未見報道。因此，本研究旨在比較分析花鰻鱺主要的養殖模式——水泥池精養（精養池）條件下不同生長速度個體腸道菌群的差異，為腸道原籍益生菌的篩選提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

試驗所用花鰻鱺取自福建龍巖大泉鰻魚養殖有限公司養殖場的方形水泥精養池中（面積為324 m2、水深1 m），養殖時間為12 個月。按魚體重量分為三組，即緩慢生長組（SG）、中速生長組（MG）和快速生長組（FG），不同組花鰻鱺平均重量分別為（83.65±9.60）g/尾、（216.98±19.97）g/尾和（386.73±51.90）g/尾；每組6個重復。

1.2 試驗飼料與飼養管理

試驗期間投喂福建天馬科技集團股份有限公司生產的黑仔鰻粉狀飼料，主要營養成分為：粗蛋白47.90%、粗脂肪6.34%、粗灰分12.12%、水分6.56%、鈣2.77%、總磷1.9%。每天6：00和18：00飽食投喂，投喂時在飼料中加入魚油（飼料干重的3%），并按料水比1∶1的比例混勻后攪拌成團狀，置于投料臺供鰻魚攝食。試驗期間精養池水溫24～30 ℃，pH值6.0～7.5，溶解氧濃度8～12 mg/L，亞硝酸鹽濃度0.15～0.22 mg/L，每天排出污水2次，每次換水量約為50 m3/池。

1.3 樣品采集

取花鰻鱺腸道樣品前禁食24 h，將其置于MS-222麻醉劑溶液中浸泡10～15 min，接著用75%乙醇沖洗魚體表面，然后用無菌剪刀和鑷子將腸道從腹腔中分離出來，用PBS 緩沖液沖洗，清除干凈腸道內容物。最后將每尾魚的中腸黏膜樣品置于1.5 mL 無菌離心管中。不同體重花鰻鱺的腸道樣品分別標記為SG組（樣品編號A1～A6），MG組（樣品編號A7～A12），FG 組（樣品編號A13～A18）。所有樣品保存于-80 ℃冰箱中直到提取DNA。

1.4 DNA的提取和腸道菌群生物信息學分析

按照Fast DNA?SPIN（MP Biomedical，USA）試劑盒的說明書進行所有樣品腸道微生物DNA 的提取，之后再利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA，檢驗合格的樣品委托北京奧維森基因科技有限公司利用Illumina MiSeq 平臺進行16S rDNA高通量測序，并對測序得到的數據進行生物信息學分析。具體步驟與檢測分析過程與Shi等[7]的研究一致。

1.5 數據統計與分析

測序得到的原始數據經過進一步的過濾得到有效數據，對有效數據進行OTUs(operational taxonomic units)聚類，默認按照0.97 的相似度進行OUT 聚類分析。利用QIIME version v.1.8 平臺分析菌群的α多樣性，分析指標包括Shannon 指數、Chao1指數和覆蓋度（coverage）。使用LEfSe 軟件分析組間相對豐度具有統計學意義的差異菌，設置LDA Score 篩選值為3.0，P＜0.05。

2 結果

2.1 腸道菌群多樣性分析（見圖1、表1）

圖1 所有樣品的腸道菌群稀釋曲線

由圖1 的稀釋曲線可知，各樣品曲線已趨于平坦，表明測序數據量合理，測序深度可靠。

表1 不同生長速度花鰻鱺腸道菌群的多樣性

由表1可知，FG組的OUTs、Shannon指數高于MG組和SG 組，MG 組的Chao1 指數高于FG 組和SG。各組的覆蓋度均接近1.00，表明該測序深度已基本覆蓋樣品所有物種。

2.2 不同組花鰻鱺腸道菌群在門水平上的組成差異（見圖2）

由圖2可知，不同組花鰻鱺腸道菌群在門水平上主要以梭桿菌門（Fusobacteria）和厚壁菌門（Fir?micutes）為主，其中MG 組和FG 組這2 個門所占比例在75%以上。在門水平上，FG 組梭桿菌門的相對豐度高于SG 組和MG 組，MG 組厚壁菌門的相對豐度高于FG 和SG 組，SG 組放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度高于FG和MG組。

圖2 不同組花鰻鱺腸道菌群在門水平上組成的差異

2.3 基于屬水平的腸道菌群LEfSe分析（見圖3）

圖3 基于屬水平花鰻鱺腸道菌群LEfSe分析

圖3 的LEfSe 分析顯示，FG 組慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和不動桿菌屬（Acinetobacter）的相對豐度顯著增加（P＜0.05），MG 組Iamia、固氮弧菌屬（Azoarcus）和厭氧黏細菌屬（Anaeromyxobacter）的相對豐度顯著增加（P＜0.05），SG組擬桿菌屬（Bacteroides）、代爾夫特菌屬（Delftia）和水棲菌屬（Enhydrobacter）等細菌的相對豐度顯著增加（P＜0.05）。

3 討論

正常魚類的腸道中存在大量的微生物菌群，腸道菌群結構受發育階段、營養水平、飲食、季節、溫度和地理位置等多種因素的影響[6-10]。在微生物學研究中，Shannon 指數是用來衡量微生物種類多樣性的指標，OTUs 和Chao1 指數通常用來估計物種總數，代表生態系統中細菌種類的豐富程度[6-7]。本研究發現FG組腸道菌群的Shannon指數高于SG組，說明快速生長的花鰻鱺腸道可能具有較高的微生物多樣性，與不同生長速度花鰻鱺腸道菌群變化的結果一致[6]。MG組的Chao1 指數在三組中最高，與不同生長速度歐洲鰻鱺腸道菌群變化的結果相同[7]，說明中速生長的花鰻鱺腸道中菌群豐度高于生長緩慢的花鰻鱺。各組覆蓋度均在99%以上，表示樣本未被測量的概率較低[11]。

本研究中，花鰻鱺腸道內的優勢菌門有梭桿菌門和厚壁菌門，其中梭桿菌門在FG組相對豐度最高，成為快速生長花鰻鱺的優勢菌門，這與之前在花鰻鱺、歐洲鰻鱺中的研究結果相似[6-7]。梭桿菌是一種厭氧的革蘭氏陰性菌，能夠產生丁酸鹽等短鏈脂肪酸，被認為是淡水魚類腸道菌群的優勢菌[7，12]。MG 組厚壁菌門的相對豐度最高，在不同生長速度大黃魚（Pseu?dosciaena crocea）腸道菌群結構的研究中也有類似結果[10]。研究表明，厚壁菌門能夠刺激魚類腸道內脂肪酸的吸收和代謝，促進宿主對能量的吸收和儲存[13]。屬于厚壁菌門的乳酸菌屬（lactobacillus）通常被認為是與健康的腸道上皮相關的有益微生物[7]。因此，相對豐度較高的梭桿菌門和厚壁菌門可能對花鰻鱺的生長產生有益作用。此外，放線菌門和擬桿菌門在生長緩慢的花鰻鱺中相對豐度較高，與緩慢生長組花鰻鱺腸道菌群中的研究結果相似[3]。有研究發現，緩慢生長的大黃魚腸道內放線菌門的含量低于正常生長的大黃魚，而擬桿菌門的含量則高于正常生長的大黃魚[10]。郁維娜等[14]通過對健康和患病凡納濱對蝦（Litopenaeus van?namei）腸道菌群分析，發現患病對蝦中擬桿菌門豐度較高而放線菌門豐度較低。這種差異的產生可能與水生動物的物種、遺傳背景及環境等因素有關[15]。

在屬水平上花鰻鱺腸道菌群LEfSe 分析結果顯示，FG組花鰻鱺腸道內，不動桿菌屬和慢生根瘤菌屬的相對豐度顯著增加。研究表明，不動桿菌是一種曾經從魚類腸道中分離出來的革蘭氏陰性菌，是花鰻鱺、日本鰻鱺腸道的優勢菌群[8,16]。Huang等[11]在不同階段歐洲鰻鱺腸道菌群組成的研究中，發現不動桿菌在歐洲鰻鱺的幼鰻腸道中占有一定比例，而在其他生長階段均未檢測到。不動桿菌屬還是銀鯽（Carassius aura?tusgibelio）、青魚（Mylopharyngodon piceus）、鳙（Para?bramis pekinensis）等淡水魚中的優勢菌屬，可有效預防病原菌感染，產生消化酶，并且有產生抑制鰻弧菌的物質的能力[8,17]。此外，在健康黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[18]、投喂益生菌后軍曹魚（Rachycentron can?adum）[19]，以及許氏平鲉（Sebastes schlegelii）仔魚、稚魚、幼魚[20]腸道中不動桿菌是最優勢菌屬。但有一些研究發現不動桿菌屬中的魯氏不動桿菌和鮑氏不動桿菌為養殖鰻鱺的致病菌，可能導致細菌性疾病的發生[21-22]。在本研究采集花鰻鱺腸道樣品過程中，未發現腸道異?，F象。由于本試驗中的16S rDNA測序未能對種水平細菌進行鑒定，還不能確定腸道內是否存有魯氏不動桿菌或鮑氏不動桿菌，這一點還有待于進一步研究?？紤]到快速生長花鰻鱺腸道中不動桿菌屬豐度的變化情況，我們認為不動桿菌屬中的一些細菌很可能是原籍益生菌，這與Hsu等[8]認為不動桿菌可能為益生菌的結論一致。慢生根瘤菌是一種對固氮有重要作用的革蘭氏陰性菌，在日本鰻鱺[8]、牙鲆（Paralich?thys olivaceus）[23]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[24]和斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[25]等魚類的腸道中均有發現，但是其功能還未見報道。

Iamia 是一種需氧型革蘭氏陽性菌，曾在鳙[17]和凡納濱對蝦[26]的腸道中被發現，在其他水生動物中還鮮見報道。固氮弧菌被認為能夠減少羅非魚（Oreo?chromis niloticus）養殖池塘中的含氮廢物污染，而厭氧黏細菌則存在于尼羅羅非魚養殖池塘的底泥中，具有降解有機質和生態修復功能[27-28]。這兩種菌的代謝可能會影響池塘中的物質循環，從而影響養殖魚類的健康狀況，但并未在其他魚類的腸道中發現，其在花鰻鱺腸道中的功能還有待進一步研究。SG 組擬桿菌屬、代爾夫特菌屬和水棲菌屬的相對豐度顯著增加，與不同生長速度花鰻鱺腸道菌群的研究結果不同，可能是養殖環境不同造成的差異[6]。擬桿菌屬是一種厭氧的革蘭氏陰性菌，淡水魚類腸道中的主要菌屬之一[8]。有研究表明，擬桿菌與宿主的關系有益生性和致病性兩方面，一方面對機體健康有利，能夠釋放抗炎物質來維持免疫系統的平衡，另一方面對機體有促炎作用，誘導結腸炎和胃炎的發生[29-30]。在本研究中，擬桿菌可能在花鰻鱺腸道中誘導腸炎發生進而造成其生長緩慢。代爾夫特菌屬是一種嚴格好氧菌，其豐度在緩慢生長組斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）腸道中較快速生長組高[5]，與本試驗結果一致。另外，代爾夫特菌屬在牙鲆[23]、歐洲舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）[31]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[32]和大西洋鮭（Salmo salar）[33]腸道中均有發現，但其主要功能尚未報道。水棲菌屬屬于γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），弧菌科（Vib?rionaceae），是存在于日本鰻鱺腸道的常見菌群，也是水產養殖動物常見的病原菌[16,34]，其相對豐度的增加與花鰻鱺生長的關系還需進一步的研究。

4 結論

精養池條件下不同生長速度的花鰻鱺腸道菌群結構存在差異，快速生長個體腸道菌群多樣性較高；一些不動桿菌屬細菌可能是其腸道中潛在的益生菌。