抗IL-1β卵黃抗體對大菱鲆生長性能、生理生化指標的影響

郭培紅 田丹陽 孫丙耀 何 穩 寇海燕 宋學宏*

（1.蘇州大學醫學部基礎醫學與生物科學學院，江蘇蘇州215123；2.貝瑞康生物科技有限公司，山東濰坊261061）

卵黃抗體（egg yolk immunoglobulin，IgY）是在抗原物質的刺激下由禽類B 淋巴細胞產生并轉移到卵黃中的多克隆抗體。卵黃抗體具有化學性質穩定、特異性強、制備簡單、成本低、口服安全等優點，并在功能性食品、生物制品及獸藥領域得到了廣泛應用[1-3]。白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是一種促炎細胞因子，主要由活化的單核細胞和巨噬細胞產生。IL-1β在機體內是一種內源性發熱源，可參與機體的多種生理及病理反應，可通過觸發和加強免疫及炎癥反應從而調節很多炎癥反應，在免疫細胞的成熟、活化、增殖和免疫調節過程中起重要的作用[4]。

大菱鲆（Scophthatmus maximus）屬于鰈形目鲆科菱鲆屬，在國內俗稱“多寶魚”，是產于歐洲的一種冷水性海產鲆鰈類。其生長迅速，耐低溫，適合高密度養殖，經濟價值高，自1992年引進我國，目前成為我國海水養殖的一個支柱產業，工業化養殖規模居全球之首[5]。然而，在當今集約化高密度養殖模式下，大菱鲆極易受到細菌、病毒和寄生蟲的感染，普遍造成炎癥反應，產生各種疾??；近年來隨魚粉資源及價格的限制，植物蛋白在海水魚類飼料中的使用越來越普遍，由此引發的腸道炎癥也逐漸引起了人們的重視[6～9]。與此同時，在全民關注食品安全的今天，以化學藥劑、抗菌素等藥物為主要病害防治手段導致的耐藥菌株、藥物殘留、環境污染等諸多問題也越來越引起人們的重視。因此，尋求符合環境友好、水產品質量安全、可持續發展戰略的病害防治措施成為水產養殖業發展的主要方向。

本試驗所用卵黃抗體，是利用大菱鲆IL-1β融合蛋白（rsmIL-1β）為抗原免疫蛋雞產生的卵黃抗體，并經水稀釋結合納米材料的方法得到的生物制品。將抗大菱鲆IL-1β卵黃抗體添加到大菱鲆基礎飼料中進行飼養試驗，通過觀察該卵黃抗體對大菱鲆生長性能和免疫保護力的影響，以期為大菱鲆的工廠化健康養殖提供參考和科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

健康的大菱鲆（約510 g）購自蘇州南環橋水產批發市場?？寺∮么竽c桿菌DH5α株、原核表達載體pET32a(+)、表達用大腸桿菌BL21(DE3)pLysS 株均購自上海生工生物有限公司；克隆載體pMD19-T、限制性內切酶EcoR I/Xho I 購自TaKaRa 公司。重組表達載體構建所采用的引物IL1βF(5'-GGA GAA TTC ATG GAA TAC AAC ATG GAG TGC-3')和IL1βR(5'-ACT CTC GAG GTA AAT CTG ACG CTG GAT GCT-3')由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。養殖試驗用健康大菱鲆幼魚[體重（14.80±0.38）g]由山東萊州明波水產有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 pET32a(+)-IL-1β表達載體的構建

采用RNAiso Plus 試劑盒（TaKaRa 公司）提取大菱鲆脾臟總RNA，并采用TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）產生cDNA；以cDNA為模板，IL-1βF 和IL-1βR 特異引物進行PCR 擴增。對擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，并利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]回收、純化特異性PCR產物，經TA克隆法連接至pMD19-T載體，送蘇州金唯智生物科技有限公司測序鑒定。將測序鑒定正確的目的片段經EcoR I/Xho I雙酶切后插入表達載體pET32a(+)質粒，獲得重組表達質粒pET32a(+)-IL-1β。

1.2.2 大菱鲆重組IL-1β蛋白(rsmIL-1β)的原核表達和純化

將表達載體pET32a(+)-IL-1β轉化E. coli BL21(DE3 pLysS)感受態細胞，在含氨芐青霉素的LB 液體培養基中振蕩過夜培養，取培養物按1∶100的比例接種到2YT誘導培養基（氨芐青霉素終濃度100 μg/mL）中，37 ℃條件下，220 r/min振蕩培養2 h后，在培養物中加入IPTG至終濃度1 mmol/L，28 ℃、100 r/min培養4 h；離心收集細胞，進行12% SDS-PAGE分析。

誘導表達的菌體經高壓細胞破碎儀（北京迪索儀器有限公司）破碎，離心收集沉淀；將沉淀用含7 mol/L 尿素的變性緩沖液充分溶解；離心得上清液；Ni-NTA 親和層析柱進行純化（蛋白質高壓制備色譜儀，法國Armen 公司，型號SPOT）；用Milipore 超濾系統（美國Milipore 公司）將洗脫液進行超濾濃縮，直至洗脫液中不含咪唑及尿素；整個操作在4 ℃條件下進行。最終獲得純化rsmIL-1β蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）測定蛋白濃度。

1.2.3 蛋雞免疫

在生物安全隔離條件好、飼養管理科學規范、雞群健康的某雞場選擇100 羽具有高免疫應答能力的正在產蛋的無特定病原體攜帶的健康產蛋雞（海蘭蛋雞，130 日齡）作為試驗雞群，飼養管理按照海蘭蛋雞產蛋期飼養管理要求進行。蛋雞首次免疫采用弗氏完全佐劑苗（購自Sigma 公司），此后免疫采用弗氏不完全佐劑苗，rsmIL-1β與佐劑1∶1 混合，雞胸肌與頸部皮下注射免疫，劑量為0.5 mL/只。同樣劑量和方法免疫3次，第1次與第2次間隔10 d，第2次與第3次間隔30 d。第1 次接種后從第20 d 開始抽檢雞蛋中抗體效價，每次抽檢10 個樣本，每個樣本由3 枚雞蛋混合而成，每7 d抽檢一次。

1.2.4 卵黃抗體的制備

收集抗體效價達到1∶5 000 以上的免疫蛋，雞蛋消毒，收集蛋黃，加入一定比例的pH 值為5.1 的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌均勻，離心得上清，即為制得的卵黃抗體。同樣方法制備普通雞蛋IgY 作為陰性對照。

1.2.5 卵黃抗體的效價測定

以rsmIL-1β作為檢測抗原，以普通雞蛋IgY作為陰性對照，PBS 為空白對照，用間接ELISA法檢測所制備的卵黃抗體效價：用碳酸鹽緩沖液（CBS：0.05 mol/L，pH 值9.6）稀釋純化的rsmIL-1β至3 μg/mL，包被96孔酶標板，37 ℃溫育1.5 h，4 ℃過夜；10%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h；每1 mL卵黃抗體加入200 μg Trx總蛋白，室溫預結合1 h后按不同倍數稀釋待檢；二抗為羊抗雞辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體（Thermo Fish?er，1∶2 500 稀釋）；鄰苯二胺顯色底物（OPD，北京百靈威科技有限公司）；2 mol/L 的H2SO4終止反應。用酶標儀（Bio-Tek，美國）在492 nm處讀取OD值。

1.2.6 卵黃抗體的特異性鑒定

菌體總蛋白及純化rsmIL-1β蛋白經12% SDSPAGE 分離后，轉至PVC 膜，分為A、B 膜，10%脫脂奶粉封閉；孵一抗：A膜為卵黃抗體，B膜為預結合的卵黃抗體（每1 ml卵黃抗體加入200 μg Trx總蛋白，室溫預結合1 h），一抗濃度均為1∶2 500稀釋；二抗為羊抗雞辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體（Sigma，1∶2 500 稀釋）；DAB（上海碧云天生物科技有限公司）顯色，純化水終止反應。

1.2.7 卵黃抗體的添加方法及大菱鲆飼養管理

大菱鲆養殖試驗在山東萊州明波水產有限公司進行?；A飼料為大菱鲆專用商業飼料（青島七好生物科技有限公司，粗蛋白50%、粗脂肪12%），對照組飼料添加0.6%的普通雞蛋IgY，試驗組飼料按0.1%、0.2%、0.4%、0.6%的劑量在基礎飼料中添加卵黃抗體，方法為將普通雞蛋IgY 和卵黃抗體均勻拌在基礎飼料表面，待充分吸收后風干并于陰涼干燥處保存備用。

試驗用魚經消毒處理，飼養馴化2 周后，挑選體質健康、個體大小均勻的幼魚600尾，隨機分配于20個養殖桶（200 L，5 個試驗組，每組4 個重復），每桶30 尾。對5組魚初始體重進行方差整齊性分析，組間差異不顯著后，開始正式試驗，試驗期間的水溫(16±1.0) ℃，鹽度(28±1)，pH 值為7.2～7.5，溶氧＞8 mg/L。日投餌3次（8：00、14：00和20：00），飽食投喂，每天投飼量為魚體重的2%左右，每次投喂過程持續30 min，之后吸取殘存餌料，65 ℃烘干稱重且從投飼量中扣除殘飼。根據魚體重量及攝食情況，及時調整投喂量。試驗過程中每天吸污并換水1/3 左右，若出現死魚，及時撈出并稱重記錄。

1.2.8 采樣及分析方法

在試驗結束時停食24 h，用MS-222將魚麻醉，然后稱重取樣。

生長指標測定：在試驗開始、結束時分別對魚體稱重。計算成活率（SR）、特定生長率（SGR）、增重率（WGR）和飼料系數（FC）。

SR(%)=100×Nt/N0

SGR(%/d)=(lnWt-lnW0)/t×100

WGR(%)=100×(Wt-W0)/W0

FC=F/(Wt-W0)

式中：N0——試驗開始時魚體總尾數（尾）；

Nt——試驗結束時魚體總尾數（尾）；

W0——試驗開始時魚體重（g）；

Wt——試驗結束時魚體重（g）；

t——養殖時間（d）；

F——飼料總攝入量（g）。

血清生理生化指標分析：血清溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（GOT）活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

1.2.9 數據處理

試驗結果采用“平均值±標準差”表示，采用SPSS17.0 經One-Way ANOVA 分析后進行Duncan's多重比較法分析試驗數據的差異顯著性，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 大菱鲆IL-1β的基因克隆及rsmIL-1β蛋白的誘導表達（見圖1～圖2）

圖1 大菱鲆IL-1β基因cDNA特異擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析

圖2 原核表達rsmIL-1β的SDS-PAGE電泳分析

由圖1顯示，以大菱鲆IL-1β反轉錄cDNA為PCR模板，采用IL-1βF 和IL-1βR 引物，經擴增獲得了大菱鲆IL-1β基因的cDNA 序列特異的產物，其大小與預測大小759 bp相符（黑色箭頭所指）。由圖2顯示，pET32a(+)/BL21經IPTG誘導表達的蛋白分子量介于20～25 kDa之間（泳道3），與Trx分子標簽（21 kDa）大小一致；pET32a(+)-IL-1β/BL21經誘導表達的蛋白在50 kDa 處顯示出較粗的條帶（泳道5），與rsmIL-1β預測大小47.12 kDa吻合。Ni-NTA親和層析柱純化后的rsmIL-1β蛋白純度可達90%以上（泳道6），BCA測定蛋白濃度可達2.18 mg/mL。

2.2 間接ELISA法檢測卵黃抗體效價結果（見表1）

以rsmIL-1β作為檢測抗原，采用間接ELISA 法檢測卵黃抗體效價，結果見表1。陰性對照組（即普通雞蛋IgY 組）OD 值小于0.1，酶標孔幾乎沒有顏色，可視為普通雞蛋IgY 無效價；而卵黃抗體組OD值在0.419～2.452 之間，遠大于陰性對照組。ELISA結果為陽性的判定標準為P/N≥2.1，其公式為：P/N=（待測OD 值-陰性對照OD 值）/（陰性對照OD 值-空白對照OD 值）。一般將P/N≥2.1 時所對應的抗體最高稀釋倍數作為抗體的效價。當卵黃抗體稀釋度至1∶16 000 時，OD 值為0.419，同時陰性對照組OD 值為0.072，P/N 為16.5，因此，可判定卵黃抗體效價為1∶16 000以上。

表1 間接ELISA法檢測卵黃抗體效價結果

2.3 卵黃抗體的特異性檢測（見圖3）

圖3 抗大菱鲆IL-1β卵黃抗體的Western blot鑒定

以卵黃抗體為一抗時，泳道中出現IL-1β和Trx蛋白條帶，同時還出現非特異性條帶，表明所制備的卵黃抗體中除含有抗IL-1β和Trx 蛋白的IgY 外，還存在能夠識別其他蛋白的IgY（見圖3A）。以Trx 總蛋白預結合卵黃抗體作為一抗時，圖中僅于50 kDa左右出現一條帶，即IL-1β條帶（見圖3B），表明Trx總蛋白能夠封閉卵黃抗體中除抗IL-1β以外的其他IgY，證明了卵黃抗體中存在能夠特異性識別IL-1β蛋白的IgY。

2.4 卵黃抗體對大菱鲆生長性能的影響（見表2）

由表2 顯示，與對照組相比，添加不同劑量的卵黃抗體對大菱鲆的成活率、特定生長率、增重率及飼料系數均有不同程度的影響。成活率、特定生長率和增重率隨卵黃抗體添加水平的增加均呈現先提高后降低的趨勢，且當添加水平在0.2%～0.4%時達到了最高值，顯著高于對照組（P＜0.05）；而與對照組相比，當添加水平達到0.6%時差異不顯著（P＞0.05）。飼料系數隨卵黃抗體添加水平的提高呈先下降后上升趨勢，與對照組相比，0.1%、0.2%添加組和0.4%添加組均顯著性降低（P＜0.05），而0.6%添加組與對照組相比略有提高，未達到顯著性水平（P＞0.05）。結果顯示，卵黃抗體在大菱鲆飼料中的適宜添加量是0.2%～0.4%。

表2 卵黃抗體對大菱鲆生長性能的影響

2.5 卵黃抗體對大菱鲆血清生理生化指標的影響（見表3）

由表3 顯示，與對照組相比，飼料中添加卵黃抗體能顯著降低大菱鲆血清中MDA 含量（P＜0.05）；當添加0.2%卵黃抗體時，大菱鲆血清SOD活性及LSZ 活性均得到顯著性提高（P＜0.05）；當添加水平在0.4%時，大菱鲆血清中GPT 活性和GOT活性顯著性降低（P＜0.05）；而當卵黃抗體含量達到0.6%時，除MDA 外，試驗組各項血清生化指標與對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。由此得出，卵黃抗體在大菱鲆飼料中的適宜添加量是0.2%～0.4%。

表3 卵黃抗體對大菱鲆血清生理生化指標的影響

3 討論

魚類生活環境復雜，極易受到細菌、病毒、內毒素等各種致炎因子刺激，導致機體免疫器官及皮膚、鰓、腸道等組織中IL-1β轉錄水平明顯上調[10]。IL-1β作為一種促炎介質，其傳遞信息、激活和調節免疫細胞、介導淋巴細胞分化，在炎癥反應過程中起到重要作用。研究表明，IL-1β過多分泌會產生炎癥風暴，對機體組織造成不同程度的傷害[11]，此過程機體消耗大量能量，造成魚類食欲下降，飼料利用率低，產量及品質降低等一系列問題。因此，我們制備了IL-1β抗體，與魚體IL-1β特異結合，從而降低IL-1β的分泌量，減少魚體的損傷并降低能耗，促進魚類生長，因而可為魚類養殖帶來潛在的經濟效益。

卵黃抗體性質穩定，能夠有效地通過動物口腔和食道，在腸道發揮作用，同時還可以在消化酶作用下降解成易被腸道吸收的具有免疫活性的小肽（Fab），轉運至血液黏附病原體，或與宿主血液中的球蛋白末端結合使其免遭機體破壞[12-13]。中華人民共和國農業農村部發布飼料“禁抗”令（第194號公告），明確要求2020年7月1日起嚴禁使用含促生長類藥物飼料添加劑。在此大背景下，卵黃抗體以其效應快，一經輸入立即獲得免疫力的特點；同時具有性質穩定（可常溫長期保存）、口服使用方便、無毒性、無致突變性、產量高、成本低[1-3]；不與哺乳動物及水產動物發生交叉血清學反應及補體系統反應、不結合類風濕因子或Fc受體[14]；營養全面、富含生物活性物質、誘食性強[15-17]等優勢，更是在水產動物疾病的防治中發揮重要的作用[18-24]，具有較好的應用前景。本研究制備的抗大菱鲆IL-1β的卵黃抗體，不僅保留了較高的生物活性（抗體效價高達1∶16 000 以上），同時兼具極佳的穩定性，可直接用作飼料添加劑。

已有研究發現，將滅活的嗜水氣單胞菌免疫產蛋雞，其得到的卵黃加入一定比例的賦形劑干燥后按0.2%的比例添加到中華鱉日糧中，發現中華鱉日增重比對照組和0.2%無特異IgY 添加組分別提高21.73%和7.24%，攝食時間分別縮短24.15%和26.06%，飼料系數分別降低13.55%和5.6%[24]。本試驗也得到相似的效果：卵黃抗體的添加可使大菱鲆的成活率提高2.5%～5.3%；特定生長率提高1.3%～11.1%；增重率提高3.1%～18.6%；飼料系數下降10.3%～16.4%（0.6%添加組除外）。適量添加卵黃抗體能促進大菱鲆生長的原因可能是其抑制了大菱鲆腸道炎癥過度發生，改善腸道健康，促進生長[25]；而過量添加后機體炎癥被過度抑制，反而影響大菱鲆機體生長及生理機能。本研究還發現，添加抗IL-1β的卵黃抗體后大菱鲆血清溶菌酶活性隨添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，當添加量為0.2%時顯著高于對照組（P＜0.05），說明適量添加卵黃抗體可以提升大菱鲆的溶菌酶免疫功能，但過量添加反而會抑制其功能，其原因可能是大菱鲆IL-1β被過度抑制后影響到了免疫細胞間的信號傳遞，具體機理有待進一步研究。

細胞在正常和病理情況下均能產生活性氧，過多的活性氧能引起機體組織的氧化應激，MDA 是脂質過氧化產物，其含量反映了上皮細胞的氧化損傷程度[26]。本研究表明添加卵黃抗體能顯著降低大菱鲆血清中MDA含量（P＜0.05），添加量在0.1%～0.2%時含量最低，隨著添加量的提高MDA含量也略有提高，試驗組之間差異不顯著（P＞0.05）。SOD 是機體內活性氧的重要抗氧化酶。本研究發現，大菱鲆血清中SOD活性隨著卵黃抗體含量的提高呈先增強后減弱趨勢，其中0.2%添加組和0.4%添加組活性顯著高于對照組（P＜0.05），0.2%添加組達到峰值。這與血清中MDA含量趨勢基本一致，表明卵黃抗體有助于提高機體清除體內自由基的能力，這與卵黃抗體抑制了機體炎癥發生有關，具體機理有待研究。

轉氨酶是催化氨基酸和酮酸之間氨基轉移的酶，主要存在于肝細胞中，是反映肝功能的重要指標，當肝細胞損傷時會釋放到血液中，導致血清中轉氨酶活性偏高[27]。本研究中，GPT 活性和GOT 活性均呈現先下降后上升的趨勢，添加0.1%～0.4%的卵黃抗體，能顯著降低血清GPT 活性（P＜0.05），但高劑量反而使GPT 活性升高；添加量為0.4%時GOT 活性顯著降低（P＜0.05），但與其他添加組差異不顯著（P＞0.05）。分析其原因可能是，腸道和肝臟交互影響，藥物解毒作用的腸肝循環、膽汁色素的腸肝循環等，生理稱為“腸-肝軸”[28]，卵黃抗體抑制了大菱鲆腸道過度炎癥的發生，改善腸道健康，從而促進了肝臟健康。

4 結論

本研究方法制備的卵黃抗體不僅保留了較高的生物活性（抗體效價高達1∶16 000 以上），而且成本低，適合規?；a；在基礎飼料中添加0.2%～0.4%的卵黃抗體，能達到提高大菱鲆生長性能、改善血清生理生化指標和提高養殖效益的目的。