牛類芽孢桿菌BD3526發酵麥麩抑制變形鏈球菌的特性

馮華峰，韓瑨，王曉花，吳正鈞*

1(乳業生物技術國家重點實驗室，上海乳業生物工程技術研究中心，食品安全與營養協同創新中心，光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海，200436)2(上海商學院 食品質量與安全系，上海，200235)

變形鏈球菌(Streptococcusmutans)是口腔中典型的致齲細菌，能牢固地黏附在牙齒表面，代謝外源性糖產酸破壞牙釉質；又能與口腔中其他細菌共聚，逐漸形成一種結構復雜的牙菌斑生物膜，從而導致齲齒的發生[1-2]。所以，抑制S.mutans的生長或控制牙菌斑生物膜的形成，是預防齲齒發生的有效措施[3-4]。

類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)微生物具有增殖速率高、抗逆能力強、營養要求低的特點，其在生長代謝過程可產生抗菌肽、功能性小肽、蛋白水解酶以及胞外多糖等多種功能物質[5]，因此具有重要的應用價值[6-9]。牛類芽孢桿菌(Paenibacillusbovis)BD3526是近期被發現的類芽孢桿菌屬的新種，其代謝產物具有多種生物學功能，也是“下一代益生菌”潛在候選者[10-12]。各種研究表明益生菌可通過抑制致病菌生長，改善口腔微生物菌群，調節口腔免疫力等方式對各種口腔疾病產生積極的防治效果[13]。

研究發現，P.bovisBD3526以麥麩為發酵介質，能合成高活力的凝乳酶[14-15]和Fusaricidin類抗菌肽[16]等功能物質。本研究采用類似的發酵材料，以麥麩為培養基、P.bovisBD3526為發酵菌株，通過生長曲線、pH值變化和對S.mutansATCC35668抑制活性的測定，再通過酶解處理、熱穩定性和pH適用范圍，以及對口腔中其他益生菌的影響等方面的研究，初步判定P.bovisBD3526所產對變形鏈球菌抑菌物質的類型及抑菌特性，為后續深入研究與產品開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：PaenibacillusbovisBD3526、唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)BD3900、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ST-III和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)LC2 W，乳業生物技術國家重點實驗室提供；StreptococcusmutansATCC35668，中國普通微生物菌種保藏管理中心。

脫脂乳(skimmed milk，SKM)培養基，配制質量濃度為40 g/L的脫脂乳液體培養基，于118 ℃滅菌15 min，冷卻備用；麥麩培養基，配制質量濃度為30 g/L(裝量為60 mL/250 mL三角瓶)，先在電爐上糊化5～10 min，再于121 ℃滅菌20 min，冷卻備用；腦心浸出液肉湯(brain heart infusion，BHI)培養基，英國OXIOD公司；TYC培養基，上海瑞楚生物科技有限公司;MRS培養基，默克化工技術(上海)有限公司。

將P.bovisBD3526劃線于TYC固體平板上，30 ℃好氧培養72 h，活化2代后，挑取1～2個單菌落，接種于質量濃度40 g/L脫脂乳粉液體培養基中(裝量為20 mL/100 mL三角瓶)，30 ℃、180 r/min搖床中培養20 h，調整至活菌數1.0×108～2.0×108CFU/mL，即得P.bovisBD3526發酵種子液。

過氧化氫酶(來源于牛肝臟)、α-淀粉酶(來源于人類唾液)、胃蛋白酶(來源于豬胃黏膜)、胰蛋白酶(來源于豬胰腺)和鏈霉蛋白酶(來源于灰色鏈霉菌)，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；脫脂乳粉，新西蘭恒天然集團；麥麩，當地農貿市場；其他有機化學試劑均是分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HVE-50型高壓滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司；GNP-9270型隔水恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；SG-402TX型超凈工作臺，美國BAKER公司；PB-100型pH計，德國賽多利斯公司；HZQ-X500C大型恒溫振蕩器，上海一恒科學儀器有限公司；BUGBOX型厭氧培養箱，英國Ruskinn公司；Millipore-Q超純水儀，美國密理博公司；RW20.n高速電動攪拌機，德國IKA公司；LABOROTA 4000旋轉蒸發儀，德國Heidolph公司；3-18K高速冷凍離心機，德國SIGMA離心機實驗室公司；Micro 17R微量臺式離心機，美國Thermo Fisher公司；MDF-U73V型醫用超低溫冰箱，日本松下電子公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 指示菌平板制備

將S.mutansATCC35668從超低溫冰箱中取出，劃線于BHI固體平板上，37 ℃厭氧條件下培養48 h，活化2代后，挑取4～5個單菌落接種于BHI液體培養基中(裝量為5 mL/10 mL)，過夜培養，4 ℃，3 000×g離心10 min，棄上清液，用無菌生理鹽水調整菌液濃度為0.5麥氏比濁標準[17]，再制備1.0×106～2.0×106CFU/mL的指示菌平板[18]。根據上述方法制備唾液鏈球菌BD3900、植物乳桿菌ST-III和干酪乳桿菌LC2 W的指示菌平板上，其中植物乳桿菌ST-III和干酪乳桿菌LC2 W是以MRS為培養基。

1.3.2 抑菌活性測定

將菌株P.bovisBD3526種子液接入麥麩培養基中，180 r/min搖床中培養，發酵36 h后收集發酵液，煮沸10 min，冷卻至室溫，pH調至5.60，4 ℃，9 000×g離心30 min，收集上清液，經無菌過濾后，移取100 μL加入牛津杯中，并放置于指示菌的平板上，37 ℃厭氧培養24 h，觀察并用十字交叉法測定抑菌圈直徑(mm)，實驗重復3次。同時以無菌發酵液(pH調至5.60)作為空白對照。

1.3.3 菌株P.bovisBD3526在麥麩培養基中的發酵特性

將菌株P.bovisBD3526種子液以3.0%(體積分數)接種量，接種于30 g/L麥麩培養基中(裝量為60 mL/250 mL三角瓶)，32 ℃、180 r/min搖床振蕩培養，于0、3、6、9、12、24和36 h，測定P.bovisBD3526發酵體系的pH值、活菌數以及發酵上清液對S.mutanATCC35668的抑菌圈直徑。

1.3.4 酶敏感性測定

分別用20 mmol/L磷酸緩沖液配制8.0 mg/mL的過氧化氫酶、α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶，調節至各酶的最適pH值(過氧化氫酶pH為7.0、α-淀粉酶pH為6.9、胃蛋白酶pH為2.0、胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶pH為7.5)。分別將各酶溶液與P.bovisBD3526發酵上清液混合后(1∶3，體積比)，在37 ℃水浴中(過氧化氫酶溫度為35 ℃)保溫3 h后，在沸水浴中處理15 min，冷卻至室溫，pH調至5.60，4 ℃，9 000×g離心30 min，無菌過濾后，測定對S.mutansATCC35668的抑菌圈直徑。以未經酶處理的樣品為對照組，實驗重復3次。

1.3.5 熱穩定性測定

P.bovisBD3526發酵上清液分別在50、60、70、80和90 ℃水浴中加熱1 h，在沸水浴中加熱30 min，以及121 ℃溫度下處理15 min，4 ℃，9 000×g離心30 min，無菌過濾后，以未經熱處理的樣品為對照組，測定抑菌圈直徑，實驗重復3次。

1.3.6 pH適用范圍測定

分別用濃度1.0 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液，調節發酵上清液pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，4 ℃，9 000×g離心30 min，無菌過濾后，以未處理的發酵液上清為對照組，測定抑菌圈直徑，實驗重復3次。

1.3.7 數據統計分析

利用GraphPad Prsim 7.00軟件進行實驗數據處理和圖表繪制，并用SPSS 24.0 的單因素方差分析來統計分析顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 菌株P.bovis BD3526在麥麩培養基中的發酵特性

菌株P.bovisBD3526在麥麩培養基中pH值和活菌數的變化如圖1所示。在6～9 h時是菌株P.bovisBD3526對數生長期，在12 h時活菌數達到峰值1.56×109CFU/mL。隨著發酵時間的延長，活菌總數開始緩慢下降，直至發酵終點(36 h)的活菌數為4.58 ×108CFU/mL。前期由于P.bovisBD3526快速生長，消耗了發酵體系中的營養物質，并積累了不利于菌體生長的代謝產物使活菌總數在后期發生降低。P.bovisBD3526發酵體系的pH值快速下降階段與菌體對數生長期基本一致，至發酵終點時pH值為5.20。培養介質中碳水化合物發酵產生的有機酸，是導致發酵體系的pH變化的主因。

圖1 菌株P.bovis BD3526在麥麩培養基中的生長曲線和發酵液pH值變化Fig.1 Variation of pH and viable counts of strain P.bovis BD3526 grown in wheat bran culture

在發酵過程中P.bovisBD3526發酵上清液對S.mutansATCC35668抑菌圈直徑的變化如圖2所示。隨著發酵時間的延長(>12 h)，發酵上清液抑菌活性依次增強。在36 h時發酵上清液的抑菌活性達到最大，其抑菌圈直徑為(21.27±0.71)mm，屬于極敏感程度。

圖2 菌株P.bovis BD3526在麥麩培養基中的抑菌活性變化Fig.2 Variation of antibacterial activity of strain P.bovis BD3526 grown in wheat bran culture

這種抑菌效果與發酵時間的正相關性表明P.bovisBD3526抑菌物質可能是其次級代謝產物，在營養物質相對充裕時，依然處于持續積累的狀態。

2.2 菌株P.bovis BD3526抑菌物質對口腔中不同細菌的影響

益生菌可通過競爭性抑制口腔病原菌黏附、定植，阻止病原菌生物膜形成，以及調節宿主黏膜免疫系統，尤其可以減少唾液中病原菌S.mutants和牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)的數量[19-20]。P.bovisBD3526發酵上清液凍干粉，在不同濃度下對S.mutantsATCC35668的抑制效果如表1所示。P.bovisBD3526抑菌物質對植物乳桿菌和干酪乳桿菌無抑菌活性，僅對鏈球菌屬細菌有強烈的抑制活性。前期的研究發現，類芽孢桿菌屬微生物合成的Fusaricidin A對需氧型革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌等)具有顯著的抑菌作用，但對變形鏈球菌的生長無影響[21]。本實驗中P.bovisBD3526麥麩發酵液對S.mutansATCC35668的特異性抑制結果，為類芽孢桿菌在防齲、治齲方面的應用提供了重要的理論依據。

表1 P.bovis BD3526發酵上清液對不同菌株的抑制效果Table 1 Antibacterial activity of fermentation supernatant of P.bovis BD3526 against different strains

2.3 菌株P.bovis BD3526抑菌物質的酶敏感性

由圖3可知，經過氧化氫酶處理后的P.bovisBD3526發酵上清液，其抑菌活性未發生顯著變化，表明發酵液中抑菌活性非過氧化氫引起的。

圖3 不同酶處理后P.bovis BD3526發酵上清液的抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of fermentation supernatant of P.bovis BD3526 after being digested by different protease

經過α-淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，發酵液上清的抑菌活性也未發生明顯變化，預示著未來此抑菌物質在攝入體內后不會被口腔和消化道中蛋白酶分解而失活。發酵液上清經鏈酶蛋白酶處理后抑菌活性完全消失(7.88±0.14)mm，說明目標抑菌物質可能存在肽類結構[21-22]。

2.4 菌株P.bovis BD3526抑菌物質的適用pH范圍

從圖4可知，不同pH(2.0～10.0)的P.bovisBD3526發酵上清液對S.mutantsATCC35668的抑制效果維持在21 mm左右，且與對照組無顯著差異，說明目標抑菌物質所具有較強的耐酸堿性能，寬泛的pH適應性極大地提高該物質的應用優勢。

圖4 不同pH條件下P.bovis BD3526發酵上清液的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of fermentation supernatant of P.bovis BD3526 at different pH values

2.5 菌株P.bovis BD3526抑菌物質的熱穩定性

由圖5可知，P.bovisBD3526抑菌物質在100 ℃處理30 min后，仍能保持對S.mutantsATCC35668較好的抑菌活性。但在121 ℃溫度下，其抑菌圈直徑(19.77±0.25)mm，與對照組(21.33±0.32)mm相比，抑菌活性有所下降。這可能是在121 ℃超高溫條件下，肽類物質中肽鍵更易發生部分斷裂或者分子結構中某些官能團發生化學反應，從而導致抑菌活性降低。

圖5 不同溫度處理后P.bovis BD3526發酵上清液的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of fermentation supernatant of P.bovis BD3526 after different heat treatments

3 結論

本文主要涉及牛類芽孢桿菌P.bovisBD3526發酵麥麩合成具有體外抑制S.mutantsATCC35668生長的研究。P.bovisBD3526以麥麩為培養介質，在發酵36 h時活性菌到4.58 ×108CFU/mL、pH值5.20，抑菌圈直徑為(21.27±0.71)mm。該發酵上清液對口腔中常見的有益菌(植物乳桿菌和干酪乳桿菌)無抑制活性，但對鏈球菌屬的唾液鏈球菌和變形鏈球菌，有明顯地抑制作用。進一步研究發現，目標抑菌物質具有良好的熱穩定性和pH穩定性、對消化系統蛋白水解酶和過氧化氫酶不敏感；經鏈霉蛋白酶處理后抑菌活性消失，表明該抑菌物質的化學結構中含有肽類成分。唾液鏈球菌K12是世界公認的口腔益生菌，可以產生2種羊毛硫抗菌肽：唾液素A2和唾液素B，具有抑制多種口腔病原菌生長活性。同樣，菌株P.bovisBD3526也具有合成多種抗菌肽或細菌素能力，但抑菌物質的分離、鑒定以及安全性評估還有待深入研究，為將來開發特異性功能食品配料或口腔護理產品奠定了重要的理論基礎。