普魯蘭酶N467G突變體的酶學性質分析

張亞楠，申培立，牛丹丹，田康明，KUGEN PERMAUL，SUREN SINGH，王正祥*

1(天津科技大學 化工與材料學院，天津，300457)2(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)3(Department of Biotechnology and Food Technology,Faculty of Applied Sciences,Durban University of Technology,Durban,4001,South Africa)

普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)是淀粉脫支酶之一，能專一性地水解淀粉分支點上的α-1,6糖苷鍵，釋放直鏈淀粉，有利于糖化酶的淀粉糖化與葡萄糖生成，從而顯著提升淀粉糖化效率與淀粉到葡萄糖的轉化率，是淀粉制糖工業中重要且不可或缺的輔助用酶[1-2]。

從20世紀80年代起，國外學者相繼發現與性能解析了多種不同來源的普魯蘭酶[3-5]。但是至今為止，在淀粉制糖工業中，僅Ⅰ型普魯蘭酶呈現出較好的與糖化酶復配或復合的作用[6]。其中，長野芽胞桿菌(Bacillusnaganoensis)普魯蘭酶(PulA)具有較高的催化活性，具備現實工業應用價值。但在應用中發現其最適作用溫度為55 ℃、最適作用pH為5.0，與黑曲霉糖化酶的最適作用溫度(60～62 ℃)和最適作用pH(pH 4.0～4.5)存在不一致性，是影響其在淀粉工業應用的重要限制因素[6-8]。

分子生物學和生物信息學技術已廣泛應用于酶分子的定向進化[9-10]。已有研究表明，通過多種分子進化技術，可以有效改善普魯蘭酶的生化屬性[11-12]。例如，王兵波等[13]利用DNA混編技術獲得了在巴斯德畢赤酵母中高效表達的普魯蘭酶嵌合體WXP03，其最適作用溫度為55 ℃，最適作用pH為4.5，基本滿足糖化工藝的需求，但最適作用溫度還有待進一步改進。再如，PANG等[14]采用定點突變方法，在Anoxybacillussp.WB42普魯蘭酶分子的Thr 245和Ala 326及Trp 651和Val 707間引入2對二硫鍵，由此獲得普魯蘭酶突變體的最適作用溫度可提高到65 ℃，提高了約5 ℃，在67 ℃下的熱穩定性得到顯著提升，其最適作用pH雖稍有降低但未獲得顯著改善。因此，通過現有酶分子進化理論方法[15]，進一步完善并優化普魯蘭酶PulA的酶學性質，使其具備與現有工業糖化酶的糖化條件的一致性，具有重要意義。

為此，本文通過定點突變PulA的N467并就酶學性質進行分析，所獲得的N467G突變體的最適作用溫度和最適作用pH獲得明顯改善，有利于其與黑曲霉糖化酶的復配使用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109用于目的基因克隆，為本實驗室保藏菌種；地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)CBBD302用于普魯蘭酶的分泌表達，為本實驗室前期構建并保藏[16];pHY-WZX為表達載體，用于介導目的基因在芽胞桿菌的分泌表達[17];pWB-PulB攜帶來自長野芽胞桿菌 ATCC 53909的普魯蘭酶基因，為本實驗室前期構建并保藏[7]。

1.1.2 酶與主要試劑

限制性內切酶、T4 DNA連接酶及蛋白質分子量標準，美國Thermo Fisher Scientific公司；PyrobestTMDNA聚合酶，大連寶生物工程有限公司；PCR產物純化試劑盒，Omega Bio-tek；硫酸卡那霉素，上海生工生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，NaCl 10.0，加入20 mg/mL的瓊脂為固體培養基。必要時，培養基中添加終質量濃度20 μg/mL硫酸卡那霉素。

普魯蘭酶鑒定培養基(g/L)：普魯蘭多糖12.0，蛋白胨5.0，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.1，加入20 mg/mL的瓊脂為固體培養基[18]。

1.2 實驗方法

1.2.1 基于氨基酸序列折疊自由能差值和3D結構模擬預測普魯蘭酶突變位點

基于氨基酸序列折疊自由能差值，按照文獻[19]介紹的方法進行計算?；具^程為：設定pH為4.0、溫度為60 ℃的條件，依據普魯蘭酶氨基酸序列中氨基酸殘基改變形成的蛋白質解折疊自由能的差值(ΔΔG)，借助計算機輔助設計與計算獲得可能的突變氨基酸位點。PulA及其突變體的3D結構模擬分析按照SWISS-MODEL方法[20]進行。

1.2.2 分子克隆操作

大腸桿菌質粒DNA的提取、酶切、轉化及轉化子篩選等按照實驗室常規方法進行[21]；地衣芽胞桿菌的遺傳轉化按文獻[16]進行；DNA純化按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 PulA定點突變

采用引物介導的定點突變方法進行測定[21]?；静襟E為：以含有PulA編碼基因的重組質粒pWB-PulB為模板，采用引物467F(5′-GGCCCTGACGGCGTAAAGAC-3′)和引物PulR(5′-CTATTTACCATCAGATGGGCTTACTT-3′)，以及引物PulF(5′-ATAGGATCCGATGGGAACACCACA-3′)和引物467R(5′-GTCTTTACACCGTCAGGGCC-3′)，分別擴增出普魯蘭酶編碼基因部分片段；再以上述擴增片段的混合物為模板，在引物PulF和PulR的介導下擴增得到突變普魯蘭酶全長編碼基因；突變位點采用Sanger核苷酸序列測定法，經核苷酸序列測定確認。

1.2.4 普魯蘭酶突變體的表達與制備

將突變后的普魯蘭酶編碼基因片段用BamH I酶切后克隆到pHY-WZX的BamH I和SmaⅠ位點中，轉化到大腸桿菌JM109中，構建獲得含普魯蘭酶突變體基因序列的重組表達質粒，重組質粒進一步轉化入地衣芽胞桿菌CBBD302中，在含20 μg/mL卡那霉素的普魯蘭酶鑒定平板上基于透明圈形成情況進行轉化子的初步篩選，根據普魯蘭酶酶活性進一步對轉化子提取質粒酶切進行驗證，并對突變體的DNA進行核苷酸序列測定，獲得正確的重組表達質粒與重組菌。

普魯蘭酶突變體的制備，采用搖瓶發酵方法進行。接種于50 mL LB培養基中，37 ℃和200 r/min條件下培養120 h，發酵結束后8 000 r/min離心10 min并收集上清液，為普魯蘭酶粗酶液。

1.2.5 普魯蘭酶突變體的純化與SDS-PAGE鑒定

將普魯蘭酶粗酶液經50%～70%飽和硫酸銨溶液進行分級沉淀后，進一步使用AKTA Pure純化系統，以0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)為流動相，采用Sephadex G-100凝膠柱(10 mm×500 mm)進行色譜分離，洗脫速度為0.5 mL/min，對色譜洗脫峰進行普魯蘭酶活力檢測，收集普魯蘭酶活性峰。酶蛋白的分離純度采用SDS-PAGE進行分析，采用12%的分離膠和5%的濃縮膠[21]。酶蛋白濃度測定參照文獻[22]進行，以牛血清白蛋白為標準品繪制標準曲線。

1.2.6 普魯蘭酶酶活力測定

普魯蘭酶酶活力按照國標GB 1886.174—2016方法[23]進行測定。普魯蘭酶酶活力單位定義：在60 ℃，pH 4.5反應條件下，1 mL酶液每1 min反應產生相當于1 μmol葡萄糖，即為1個酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.7 最適作用溫度及熱穩定性測定

在pH 4.5下，分別測定酶樣在45、50、55、60、65和70 ℃下的酶活力，以最高酶活力為100%，計算其余溫度下的相對酶活力，確定最適作用溫度。將酶樣分別在45、50、55和60 ℃下熱處理1 h，每隔0.5 h取樣，按1.2.6小節中酶活力的測定方法測定殘余酶活力，以未經處理的酶樣酶活力為100%，確定酶的熱穩定性。

1.2.8 最適作用pH及pH穩定性測定

在最適反應溫度下，用pH 3.5～7.0的緩沖液適當稀釋酶液，測定對應pH條件下的酶活力，以最高酶活力為100%，計算其余pH條件下的相對酶活力，確定最適作用pH。將酶樣加入不同的pH緩沖液中室溫(25 ℃)放置1 h，然后按1.2.6小節中酶活力的測定方法測定殘余酶活力，以未經處理的酶液酶活力為100%，確定其pH穩定性。

2 結果與討論

2.1 PulA突變位點選擇

通過對普魯蘭酶氨基酸序列中氨基酸殘基改變形成的蛋白質解折疊自由能的差值(ΔΔG)分析，發現PulA分子中第467位的天冬酰胺殘基突變可能會改變其酶學性質及其耐熱耐酸性能。進一步借助PulA 3D模擬結構(圖1-a)，分析了PulA第467位的天冬酰胺殘基突變為甘氨酸后的結構變化(圖1-b)，發現N467G突變后的普魯蘭酶分子，甘氨酸側鏈基團為氫，是疏水基團，可以與周圍氨基酸殘基形成疏水相互作用，并主要影響蛋白質的構象熵，是蛋白質三級結構形成的驅動力，通過降低蛋白質表面的疏水性，增加內部的疏水性來維持蛋白質內部的穩定[24]。故第467位天冬酰胺殘基突變后有可能提升酶分子的耐熱性。

a-PulA；b-N467G突變體圖1 PulA第467位氨基酸位點突變前后結構比較Fig.1 Deduced structure of PulA before and after mutation of the Asn467 residue注：a、b圖的左上角均為突變位點放大圖

2.2 N467G突變體的構建與制備

基于以上分析，普魯蘭酶PulA的第467位天冬酰胺殘基突變對耐熱耐酸性能可能產生影響，對此氨基酸殘基進行定點突變，獲得了相應的突變體N467G，其在相應宿主菌中具有普魯蘭酶活性。將此突變體編碼基因在地衣芽胞桿菌中進行分泌表達，并通過搖瓶發酵進行酶液的制備并進一步純化，純化后的普魯蘭酶突變體N467G在SDS-PAGE圖譜上呈現單一條帶，條帶位置與其理論分子質量大小101 kDa相吻合(圖2)，比酶活力較野生型PulA提高了約11%。

圖2 突變體N467G純化后的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE diagram of the purified mutant N467G

2.3 N467G突變體的酶學性質

2.3.1 最適作用溫度和最適作用pH

在pH 4.5的條件下，測定45～70 ℃范圍內普魯蘭酶突變體N467G的酶活力，結果如圖3-a所示。

a-溫度；b-pH圖3 溫度和pH對普魯蘭酶突變體N467G活力的影響Fig.3 Effects of temperature and pH on the activity of the mutant N467G

突變體N467G在60 ℃時表現出最高酶活力，其最適作用溫度較PulA提高了5 ℃，最適作用溫度顯著提高；在黑曲霉糖化酶的最適作用溫度(60～62 ℃)附近，突變體N467G的相對酶活力為其最高水平，而此時PulA相對酶活力僅為70%左右，表明在作用溫度層面突變體N467G更適合與黑曲霉糖化酶的配合使用。進一步評價了pH對普魯蘭酶突變體N467G酶活力的影響，結果如圖3-b所示。突變體N467G的最適作用pH為4.5，較PulA降低了0.5個pH；在pH 4.0～5.0之間N467G的酶活力均保持在80%以上，PulA同樣范圍內僅有60%的酶活力，表明N467G比野生型更有利于在酸性條件下發揮催化作用。

2.3.2 熱穩定性和pH穩定性

將酶液在55和60 ℃下保溫3 h，定時取樣分析剩余酶活力，結果如圖4-a所示。突變體N467G在55和60 ℃孵育1.5 h后保留80%以上的酶活力，2.5 h后仍保留70%和50%以上的酶活力，而PulA在各取樣點的相對酶活力均低于突變體N467G，在55和60 ℃下保溫2.5 h后，其酶活力僅保留50%和40%，突變體N467G的熱穩定性較PulA顯著提升。進一步將酶液在不同pH緩沖液中室溫放置1 h后測其剩余酶活力的結果如圖4-b所示。突變體N467G在pH 3.5～6.0，皆具有良好的穩定性，酶活力均保留60%以上，N467突變后其分子的耐酸性得到了顯著提升。

a-熱穩定性；b-pH穩定性圖4 突變體N467G的熱穩定性和pH穩定性Fig.4 The thermostability and pH stability of the mutant N467G

本研究通過對長野芽胞桿菌普魯蘭酶的氨基酸序列分析與預測，以定點突變方法改造酶分子并制備相應的普魯蘭酶突變體，所獲得的突變體N467G的最適作用溫度較親本提高了5 ℃，最適作用pH降低了0.5，其最適作用條件與現有糖化酶作用條件相吻合。此外，該突變體的pH穩定性和熱穩定性也有顯著提升?？梢?，本研究獲得的普魯蘭酶新突變體具備了與糖化酶復合使用的基本條件。

已有研究揭示，酶分子特定部位的天冬酰胺殘基在高溫條件下發生脫酰胺作用，是導致酶蛋白熱變性的重要原因之一[24]。本研究中普魯蘭酶PulA第467位的天冬酰胺殘基定點突變為甘氨酸后，因甘氨酸側鏈是疏水基團，可以與周圍氨基酸殘基通過疏水相互作用來維持蛋白質結構的穩定，從而顯著提升了突變體的熱穩定性。本研究同時發現，N467G突變后，其最適作用pH和pH穩定性也發生期望的突變，這一變化的可能機理尚不清楚，將在后續進一步闡明。

3 結論

通過對B.naganoensis普魯蘭酶第467位天冬酰胺殘基的定點突變，獲得了普魯蘭酶突變體，最適作用溫度為60 ℃，最適作用pH為4.5，與現有工業化生產中使用的糖化酶的最適作用條件相吻合，其應用可改進現有淀粉制葡萄糖生產工藝。