屎腸球菌源谷氨酸脫羧酶的制備及其酶學性質研究

楊勝遠，林謙，劉淑敏，蘇巧云，黃慧玲

1(嶺南師范學院 食品科學與工程學院，廣東 湛江，524048)2(玉林師范學院 生物與制藥學院，廣西 玉林，537000)

谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)是生物合成γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid,GABA)和拆分手性DL-谷氨酸(DL-glutamic acid，DL-Glu)的重要工業用酶[1-3]。已有研究表明，屎腸球菌(Enterococcusfaecium)具有很強GAD活性，具有良好的應用前景[3-6]。然而，天然酶的純化非常困難，如唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcussalivariusssp.thermophilus) GAD需要經過硫酸銨分級沉淀、等電點沉淀、DEAE-Sephadex A-50離子交換層析、HiPrep16/10 Phenyl FF疏水層析和Sephadex G-100凝膠層析等5步純化才能達到電泳純[7]。因此，研發快捷、低成本、高效、綠色的新型純化技術，對純酶制劑的生產具有重要意義。

纖維素結合域(cellulose-binding domain,CBD)是大多數纖維素降解酶的重要結構域之一，負責酶的識別和與底物的結合[8-10]。CBD利用能與纖維素發生特異結合的特性，已成為一種新型親和標簽，用于融合蛋白的純化或固定化[11-13]。內含肽(intein)是類似內含子的一段多肽，蛋白質翻譯后可通過內含肽自催化N-或C-末端剪切作用而實現與前體蛋白分離[14]，已成功作為蛋白質連接的蛋白質構建塊用于蛋白質的純化[15-16]。如能綜合CBD和內含肽的特性，在CBD和GAD之間插入內含肽，通過適宜的不溶性載體對CBD融合特異親和吸附將融合酶與雜蛋白分離，再通過內含肽的自剪切作用使GAD脫離，即可在不使用蛋白酶的情況下制備出GAD純酶。這一策略的實現將依賴于3個主要條件：① 纖維素結合域-內含肽-谷氨酸脫羧酶(CBD-intein-GAD)能否高效表達，這是獲取優質酶源的關鍵和基礎；② 載體對CBD是否具有較強特異性吸附，特異性不高則可能存在雜蛋白吸附，吸附力不強則可能在自剪切過程中出現CBD-intein-GAD與載體脫吸附，都會造成GAD不純；③ 自剪切條件是否適宜，會直接影響GAD能否與載體-CBD-intein有效分離，與GAD純度和產量密切相關。

本實驗主要以來源于熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)的家族3的CBD、集胞藻(Synechocystissp.PCC6803)的內含肽DnaB和屎腸球菌GAD核苷酸序列，對融合酶CBD-DnaB-GAD的構建、GAD純化及其酶學性質進行探討，以期為GAD純酶制劑的生產提供應用和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EscherichiacoliDH5α用于融合酶的表達，由林謙博士提供。E.coliGDMCC60446為本實驗構建的重組菌株，可高效表達融合酶CBD-DnaB-GAD，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心。

TransStart FastPfuDNA聚合酶,全式金生物技術公司；DNA膠回收試劑盒和細菌基因組提取試劑盒,康為世紀生物技術公司；TaqDNA聚合酶、pMD19 Simple T載體和In-fusion HD 基因克隆試劑盒,大連寶生物工程公司。GABA(質量分數≥99%)和5′-磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate,PLP),美國Sigma-Aldrich公司；氨芐青霉素(Ampicillin,Amp， 鈉鹽，美國藥典級)和層析柱(60 mL,26.2 mm×134 mm),生工生物工程(上海)有限公司；超濾離心管(截留分子質量2 kDa),德國Sartorius集團；其他試劑為市售生化試劑、色譜純或分析純試劑。

pRPOCDN為自行構建的E.coli質粒，主要在pUC57質粒中插入了脅迫誘導型啟動子PrpoS、CBD編碼序列cbm3、內含肽DnaB編碼序列dnaB和T7終止子序列。gadB基因為課題組前期研究以E.faeciumGDMCC60203基因組DNA為模板，通過PCR擴增和純化自行制備，大小為1 401 bp[17]。所用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

Luria-Bertani(LB)培養基參照文獻[18]配制。培養E.coliGDMCC60446的LB培養基含100 μg/mL Amp。

再生無定形纖維素(regenerated amorphous cellulose，RAC) 按照文獻[19]的方法制備。

1.2 儀器與設備

1200 Series高效液相色譜儀,美國安捷倫公司；Auw120電子分析天平,日本島津公司；HZQ-F100恒溫振蕩培養箱,金壇市精達儀器制造有限公司；TGL16M臺式高速冷凍離心機,鹽城市凱特實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1E.coliDH5α和E.coliGDMCC60446培養

參照文獻[17]進行培養。菌株 DH5α采用不含Amp的LB液體培養基進行培養，GDMCC60446重組菌株則以含Amp的LB液體培養基進行培養。

1.3.2 GAD酶活力測定

除特別說明外，GAD酶活力測定條件為：0.5 mL GAD酶液與1.5 mL 0.25 mol/LL-Glu溶液(pH 5.0，溶于0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，含0.2 mmol/L PLP)混合，40 ℃水浴反應1 h，加入4 mL無水乙醇，混勻、終止反應，8 500 r/min離心15 min，取上清液測定GABA含量。酶活力單位定義：測定條件下1 h生成1 μmol GABA所需要的酶量為1個酶活力單位(U)。除設置了對照組的實驗以對照組平均GAD酶活力為100%外，其余均以酶活力最高的實驗組平均GAD酶活力為100%計算相對酶活力(%)。

1.3.3 GABA分析

GABA參照文獻[17]采用高效液相色譜進行分析。

1.3.4 CBD-DnaB-GAD重組E.coli的構建

1.3.4.1 表達載體及重組菌的構建

以5′-GCGGCCGCCCATGGCTCTTCCG-3′和5′-GAATTCCTCGAGGGCTCTTCCAG-3′為引物，以pRPOCDN作為模板，通過PCR擴增制備含有內含肽編碼序列dnaB的4.2 kb線性化載體，電泳切膠，回收純化線性化載體，與gadB進行組裝，構建pRPOCDN-EfagadB重組質粒。PCR擴增和拼接組裝參照文獻[17]進行。以pRPOCDN-EfagadB轉化感受態E.coliDH5α細胞。提取單菌落的質粒并經BamH I、EcoR I雙酶切后進行電泳檢測，已轉化了pRPOCDN-EfagadB的菌株即為重組E.coliGDMCC60446。

1.3.4.2 CBD-DnaB-GAD的表達

將重組菌株GDMCC60446培養液于4 ℃、8 500 r/min 離心15 min，收集菌體。將濕菌體與生理鹽水按1∶20(g∶mL)混合，攪拌分散洗滌菌體，再次離心收集菌體，然后將濕菌體與Tris-HCl 緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0)按1∶15(g∶mL)混合，冰浴中超聲波破碎細胞(400 W，工作5 s，冷卻5 s，全程50 min)，離心收集上清液即為CBD-DnaB-GAD粗酶液。將15 mL粗酶液與 0.9 g(濕質量)RAC混合，30 ℃、50 r/min振蕩10 min，轉入小層析柱，蠕動泵抽濾去除液體，固體基質即為RAC-CBD-DnaB-GAD。在小層析柱中，以40 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)分4次洗滌RAC-CBD-DnaB-GAD，蠕動泵抽濾去除洗滌液。取已洗滌的0.2 g RAC-CBD-DnaB-GAD，加入10 mL 0.25 mol/LL-Glu溶液(pH 5.0，溶于0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，含0.2 mmol/L PLP)，混合，40 ℃水浴反應1 h，按體積比為1∶2的比例將反應液與無水乙醇混合終止反應， 8 500 r/min離心15 min，取上清液分析轉化產物GABA。

1.3.5 GAD純酶制備

分別以均含0.5 mol/L NaCl和1 mmol/L EDTA的pH 6.5 Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，記為A)、pH 6.5磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(0.2 mol/L,記為B)、pH 5.6乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.2 mol/L，記為C)作為自剪切液，通過比較剪切制備的酶液的GAD活性評價RAC-CBD-DnaB-GAD在不同自剪切液中的剪切效果。按照1.3.4.2小節的方法制備和洗滌RAC-CBD-DnaB-GAD，然后分別在層析柱中加入30 mL自剪切液浸泡RAC-CBD-DnaB-GAD，30 ℃保溫12 h，蠕動泵抽濾，將濾出液用超濾離心管于3 000 r/min進行超濾，當管內剩余約1 mL液時加入5 mL 50 mmol/L EDTA醋酸-醋酸鈉溶液(含0.2 mmol/L PLP)，再次離心，如此重復超濾5次，然后用醋酸-醋酸鈉溶液定容至10 mL，即為GAD純酶液。

GAD純度和分子質量采用SDS-PAGE電泳進行分析，濃縮膠質量分數為5%濃度，分離膠質量分數為8%，膠厚1.0 mm。蛋白質濃度按照試劑盒說明書采用Bradford法測定。分子質量根據標準蛋白質和GAD的SDS-PAGE電泳遷移率進行計算，并結合由gadB序列推算的理論分子質量判斷GAD的亞基組成。

1.3.6 GAD酶學性質研究

1.3.6.1 pH對GAD的影響

pH對GAD反應活性的影響：分別以pH 4.0～5.8(梯度0.2)的0.25 mol/LL-Glu溶液(溶于0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，含0.2 mmol/L PLP)作為底物進行酶活力測定。pH對GAD穩定性的影響：先將GAD酶液通過離心超濾將原酶液的溶劑(乙酸-乙酸鈉緩沖液)替換為含0.2 mmol/L PLP的生理鹽水，再分別與pH 3.6～5.8 (梯度0.4)的50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液或0.2 mmol/L PLP的生理鹽水按1∶1混合作為酶液；將pH 3.6～5.8組各酶液于40 ℃保溫5 h，分別測定處理后的GAD酶液的殘余酶活力，以4 ℃保存的生理鹽水組酶液為對照。

1.3.6.2 溫度對GAD的影響

溫度對GAD反應活性的影響：分別在40～70 ℃(梯度5 ℃)下測定GAD酶活力。溫度對GAD穩定性的影響：先將GAD酶液分別于-25、-20、-7、4、40、50、60和70 ℃ 保溫3 h，室溫靜置1 h，然后再分別測定已恢復至室溫的GAD酶液殘余酶活力，以4 ℃處理組為對照。

1.3.6.3 化學試劑對GAD活性的影響

在GAD酶活力測定的反應體系中分別加入50 μL 0.2 mol/L 的ZnSO4、CuSO4、MnSO4、MgSO4、NaCl、KCl、CaCl2、FeCl2、FeCl3、AlCl3、Pb(CH3COO)2、AgNO3、EDTA-2 Na、乙二醇(ethylene glycol，EG)溶液，快速混勻，即各化合物的終濃度為5 mmol/L。以加蒸餾水50 μL作為對照。55 ℃水浴反應1 h。

1.3.6.4 GAD底物特異性

分別以溶于0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液的0.25 mol/LL-Glu、D-Glu和L-Asp溶液(pH 5.0，均含0.2 mmol/L PLP)作為GAD底物，參照文獻[17]于55 ℃測定GAD底物特異性。以121 ℃滅活10 min的GAD酶液作為對照。

1.3.6.5 GAD動力學常數

參照文獻[17]分別以pH 5.0的不同濃度的L-Glu溶液(溶于0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，含0.2 mmol/L PLP)作為底物于55 ℃反應5 min進行GAD酶活力測定，并計算GAD的Km和Vmax。

1.3.6.6 GABA對GAD活性的影響

以分別含0.1、0.2 mol/L GABA的0.25 mol/LL-Glu溶液作為底物于55 ℃水浴反應1 h，以新增GABA的量計算GAD酶活力。以不添加GABA的0.25 mol/LL-Glu溶液按同樣操作作為對照。

1.4 數據分析

利用IBM SPSS Statistics 19.0軟件采用單因素方差分析(ANOVA)的Duncan法進行統計分析。圖表中不同的英文字母表示兩組間差異顯著(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 CBD-DnaB-GAD重組E.coli的構建

2.1.1 表達載體及重組菌的構建

經PCR擴增得到含有內含肽編碼序列dnaB的4.2 kb線狀載體骨架，將該線狀載體骨架與gadB基因拼接后，得到pRPOCDN-EfagadB重組質粒(圖1)，該重組質粒全長為5 652 bp，包含了脅迫誘導型啟動子PrpoS(743 bp)、CBD編碼序列cbm3(480 bp)、DnaB編碼序列dnaB(522 bp)和屎腸球菌GAD基因gadB(1401 bp)。經用BamH I和EcoR I雙酶切，酶切產物電泳結果與pRPOCDN-EfagadB重組質粒的核苷酸序列理論推斷(理論應得到3 723和1 929 bp兩個片段)一致，說明pRPOCDN-EfagadB重組質粒成功構建。將pRPOCDN-EfagadB轉化E.coliDH5α，獲得攜帶CBD-DnaB-GAD表達載體的重組菌株E.coliGDMCC60446。

PrpoS-脅迫誘導型啟動子，包含E.coli中 5′-非翻譯區；cbm3-來自Clostridium thermocellum家族3纖維素結合域的編碼序列;dnaB-來自Synechocystis sp.PCC6803的內含肽DnaB的編碼序列；gadB-來自E.faecium GAD的基因圖1 pRPOCDN-EfagadB示意圖Fig.1 Diagram of pRPOCDN-EfagadB

2.1.2 CBD-DnaB-GAD的表達

因E.coli自身基因組也可表達GAD[20]，同時通過DnaB自剪切分離的GAD也可能會因發生高級結構的重折疊而失活，因此為了避免E.coli自身GAD的干擾，精確反映是否成功表達具GAD活性的CBD-DnaB-GAD，故通過直接測定經RAC吸附分離后的RAC-CBD-DnaB-GAD的GAD酶活力反映CBD-DnaB-GAD的表達情況。經HPLC分析，轉化液GABA濃度為(87.69±4.46) mmol/L。結果表明重組菌株GDMCC60446可表達具GAD酶活力的CBD-DnaB-GAD。

2.2 GAD純酶的制備

通過RAC與CBD親和吸附特性僅可實現將CBD-DnaB-GAD從粗酶液中分離出來，尚需進一步通過DnaB自剪切作用才能獲得GAD。經對RAC-CBD-DnaB-GAD在不同剪切液中的自剪切效率進行探討，結果如圖2所示，在0.2 mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中自剪切效率最高，獲得的酶液GAD活性最強。SDS-PAGE電泳結果(圖3)表明GAD酶液為單一條帶，說明制備獲得的GAD達到電泳純。根據SDS-PAGE電泳的相對遷移距離可求得GAD的分子質量為55.68 kDa，與由gadB核苷酸序列推算的GAD理論分子質量53.71 kDa基本相符，確認切割分離出了GAD，并表明GAD只由1個亞基組成。

剪切液是影響內含肽發生自剪切作用的重要因素，含NaCl和EDTA的Tris-HCl緩沖液常被用作內含肽DnaB的剪切液[15-16]，然而圖2顯示在pH、NaCl和EDTA同等的條件下，0.2 mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的剪切效果顯著優于Tris-HCl緩沖液(P<0.05)，可能與不同緩沖液的離子強度存在差異有關。

A-50 mmol/L Tris-HCl緩沖液；B-0.2 mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液；C-0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液圖2 不同剪切液中RAC-CBD-DnaB-GAD的自剪切效率Fig.2 Self-cleavage efficiency of RAC-CBD-DnaB-GAD in different cleavage solutions注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

1-蛋白質Marker;2-CBD-DnaB-GAD粗酶液;3,4，5-純化后GAD酶液圖3 SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electrophorogram

2.3 GAD純酶酶學性質

2.3.1 pH對GAD的影響

圖4-a顯示，當反應pH<5.0，GAD酶活力隨pH增加而增強；當反應pH=5.0，GAD酶活力最強；當反應pH>5.0， GAD酶活力隨反應pH增加而逐漸下降，但在pH 5.0～5.2,GAD酶活力變化不大，差異不顯著(P>0.05)。結果表明，GAD最適反應pH為5.0。圖4-b顯示，當溶液pH為4.8～5.8時，40 ℃保溫5 h仍較穩定，但當pH<4.8，則穩定性顯著降低(P<0.05)。pH對GAD反應活性的影響較對CBD-GAD[22]的影響大，但對GAD和CBD-GAD[17]的穩定性影響較為相似，可能與CBD增大了蛋白質的分子量或輕微改變了酶蛋白的結構有關。

a-GAD反應活性;b-GAD穩定性圖4 pH對GAD反應活性和穩定性的影響Fig.4 Effect of pH on the catalytic activity and stability of GAD

2.3.2 溫度對GAD的影響

圖5-a顯示， GAD在55～60 ℃可保持95% 以上的酶活力，超出該溫度范圍，GAD反應活性快速下降。最適反應溫度為55 ℃，但在55和60 ℃的GAD酶活力無顯著性差異(P>0.05)。由圖5-b可見，分別在-25～55 ℃的不同溫度保溫3 h，GAD殘余酶活力與4 ℃處理組無顯著性差異(P>0.05)，孵育溫度升高則GAD殘余酶活力快速降低，說明GAD在-25～55 ℃相對較穩定。

文獻表明，CBD-GAD的最適反應溫度為60 ℃，在4～40 ℃較穩定，冰凍處理(低于-7 ℃)和高于50 ℃處理對CBD-GAD穩定性影響較大[17]。GAD與CBD-GAD對溫度的依賴性存在一定差異，可能與CBD增大了蛋白質的分子質量或輕微改變了酶蛋白的結構有關。

a-GAD反應活性;b-GAD穩定性圖5 溫度對GAD反應活性和穩定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the catalytic activity and stability of GAD

2.3.3 化學試劑對GAD活性的影響

由于酶的結構不同，化學因素對酶的影響是多種多樣的。為了闡明化學因素對屎腸球菌GAD的影響，在反應體系中分別添加不同的化學試劑至終濃度為5 mmol/L。如圖6所示，NaCl、CaCl2和乙二醇對GAD酶活力影響不大(P>0.05)，KCl、EDTA-2Na、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、MgSO4、FeCl2、FeCl3、AlCl3、AgNO3和Pb(CH3COO)2對GAD酶活力具有不同程度的抑制作用(P<0.05)，其中KCl和EDTA-2Na抑制作用相對較弱，而AgNO3和Pb(CH3COO)2具有強抑制作用,在GAD應用中應避免存在這些化學物。

圖6 化學試劑對GAD活力的影響Fig.6 Effect of chemical reagents on the activity of GAD

反應液中的化學組分是影響酶活力的重要因素之一。文獻表明，Ca2+對LactobacillusfermentumYS2[13]、Lactobacillusbrevis877G[21]、LactobacillusparacaseiNFRI7415[22]和LactobacillussakeiA156[23]的GAD酶活力具有促進作用，然而對S.salivariusssp.thermophiles[7]和Bacillusmegaterium[24]的GAD沒有明顯影響。本實驗結果表明Ca2+對屎腸球菌GAD酶活力的影響與其對S.salivariusssp.thermophiles[7]和Bacillusmegaterium[24]GAD的影響基本一致。

2.3.4 GAD底物特異性

表1顯示，GAD具有很強的底物專一性，僅對L-Glu具有催化活性，對L-Glu的異構體D-Glu和與僅有1個—CH2差異的L-Asp均無催化活性，與CBD-GAD[17]一致，說明CBD未改變GAD的底物特異性。

表1 GAD的底物特異性Table 1 Substrate specificity of GAD

2.3.5 GAD動力學常數

圖7顯示，L-Glu濃度低于19.2 mmol/L時，反應呈一級反應；L-Glu濃度在19.2～76.8 mmol/L，反應呈混合級反應；L-Glu濃度高于76.8 mmol/L，反應呈零級反應。結果表明，GAD催化反應沒有底物抑制現象，符合Michaelis-Menten的快速平衡學說。通過Lineweaver-Burk作圖法進行計算，GAD的Km和Vmax分別為10.51 mmol/L和3.41 μmol/(mL·min)。底物濃度對GAD的影響和GAD動力學常數均與CBD-GAD[17]相似。

圖7 L-Glu濃度對GAD催化反應速度的影響Fig.7 Effect of L-Glu concentration on the catalytic reaction rate of GAD

2.3.6 GABA對GAD活性的影響

圖8顯示，當在初始L-Glu底物溶液中添加 0.1 mol/L 和0.2 mol/L 的GABA時，GAD酶活力與未添加GABA的對照組無顯著性差異(P>0.05)，說明GABA對GAD催化活性無抑制效應。結果與CBD-GAD[17]一致。

圖8 GABA對GAD活性的影響Fig.8 Effects of GABA on GAD activity

3 結論與討論

微生物通過GAD催化L-Glu的α-羧基發生脫羧作用生成GABA，提高細胞微環境的pH值，抵抗酸性環境對其生長繁殖的不利影響，這是微生物的耐酸機制之一[25]，即野生株GAD在生理上是為了滿足抗酸需要，通常表達量不高，遠不能滿足工業用酶需求，因此通過基因工程技術構建重組菌高效表達GAD將是解決工業用酶的重要途徑。同時，GAD是胞內酶，細胞破碎提取液的雜蛋白多，酶的分離純化困難，也是限制GAD的研究和應用的重要原因。本實驗通過以CBD作為親和標簽，并利用內含肽DnaB的自剪切作用，構建和表達融合酶CBD-DnaB-GAD，通過RAC一步純化即可獲得屎腸球菌GAD純酶，操作簡便、成本低。由于通過DnaB自剪切作用，去除了CBD-DnaB序列，可避免CBD和DnaB對GAD酶學性質的影響，GAD性質更接近于天然酶。