噪聲損傷和苯扎貝特干預對豚鼠耳蝸脂肪酸轉運蛋白1和4表達的影響△

胡一勇 石敏 楊風波 呂萍 蔣晴晴 袁碩龍 張悅 楊仕明 于寧

脂肪酸轉運蛋白1和4(fatty acid transport protein，FATP1，FATP 4)對長鏈脂肪酸具有高度親和力而參與各類組織和器官的脂肪酸攝取、轉運[1, 2]。既往研究發現豚鼠耳蝸Hensen細胞含有大量脂滴——中性脂肪酸[3]，但是其轉運體FATP1和/或FATP4是否在耳蝸內表達并參與耳蝸脂肪酸代謝從而調節耳蝸功能目前少有研究。少量研究[4,5]發現噪聲暴露會導致豚鼠耳蝸Hensen細胞分泌脂滴以及小鼠耳蝸Hensen細胞高度降低，提示脂肪酸因噪聲等因素在耳蝸內被轉運。據此本研究采用中高強度白噪聲長時間刺激耳蝸建立噪聲性耳聾動物模型，并使用提高FATP表達、促脂肪酸β-氧化的藥物苯扎貝特干預[6]，試圖提高耳蝸內FATP表達，以促進Hensen細胞分泌脂滴，然后觀察噪聲及藥物干預前后脂肪酸轉運體1和4在耳蝸的變化，從而探索耳蝸內脂肪酸以及FATP1、FATP4與噪聲性聽力損失的關系，為進一步探討脂肪酸代謝調節耳蝸功能的機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康成年雄性Dunkin Hartley豚鼠21只，體重250～300 g，耳廓反射靈敏，購自北京市科宇動物養殖中心，動物實驗許可證號SYXK(川)2018-18。將21只聽力正常豚鼠隨機分為對照組15只(30耳)、干預組6只(12耳)。

1.2主要試劑和設備 主要試劑：苯扎貝特(sigma，B7273)、Mouse Anti-FATP1 primary antibody(Abcam，ab69458)、Rabbit Anti-FATP4 primary antibody(Invitrogen，PA5-42446)、Rabbit Anti-Myosin 7a primary antibody(Abcam，ab3481)、Goat Anti-mouse Alexa Fluor 555(Abcam， ab150114)、 Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 647(Abcam，ab150083)、特異性脂肪酸探針Nonpolar BODIPY Probes 493/503(Invitrogen，D-3922)，封閉用山羊血清(absin，abs933a)、0.01M PBS、4%組織細胞固定液(CoolabeR SL1830)、Triton X-100(sigma，9002-93-1)、10% EDTA(Coolaber SL-3070)，二甲基亞砜(Coolaber，CD4731)；Mouse Anti-Beta-actin primary antibody(Affinity，T0022)，山羊抗兔IgG(H + L) HRP(ZSGB-BIO，ZB-2301)、山羊抗鼠IgG(H + L) HRP(ZSGB-BIO，ZB-2305)、RIPA Lysis Buffer(康為世紀，CW2334)、BCA法蛋白質定量試劑盒(普利萊，P1511)、Super ECL Plus 超敏發光液(普利萊，P1010)。

主要設備及耗材：解剖顯微鏡(Olympus，日本)、共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8)、TDT測聽儀器(TDT III設備，美國)、電泳儀(Tanon VE-180)、轉膜儀(Tanon VE-186)、凝膠成像儀(賽智 610C)、顯微鑷、組織剪、3 ml塑料滴管等。

1.3聽性腦干反應(ABR)檢測 對照組及干預組分別在開始噪聲暴露前及暴露后的第6天、第12天、第24天進行ABR檢測。用1%戊巴比妥鈉麻醉豚鼠，連接TDT電極：記錄電極從耳廓前緣連線中點進針植入顱頂皮下，參考電極植入測試耳乳突部皮下,接地電極植入對側耳乳突部皮下。耳機置于測試耳外耳道口0.2 cm處。采用Biosig32 軟件系統檢測豚鼠短聲(click)、短純音(tone burst)(4、8、16 kHz)ABR反應閾。刺激聲強度設定為90 dB SPL，按10 dB遞減，在接近反應閾時刺激聲強度遞減間隔為5 dB，以能分辨出可重復的ABR波Ⅲ的最低刺激強度為閾值。

1.4噪聲性聾動物造模 噪聲暴露前隨機選取對照組3只(6耳)豚鼠進行耳蝸取材作為正常對照。然后將對照組其余12只(24耳)和干預組6只(12耳)豚鼠置于50 cm×30 cm×25 cm的籠內，每只豚鼠之間用隔板隔開，揚聲器置于籠的上方，控制豚鼠活動范圍內的聲強相差不大于2 dB，使用110 dB白噪聲連續暴露12天、每天4小時；干預組在開始噪聲暴露同時予以苯扎貝特(5 mg·kg-1·d-1)灌胃干預。

1.5耳蝸冰凍切片制作 對照組在噪聲暴露后第12、24天進行耳蝸取材，干預組在第24天取材。用1%戊巴比妥鈉麻醉豚鼠，待其進入深度麻醉狀態后，立即斷頸處死；快速取出耳蝸，置于4%多聚甲醛溶液中。在體視顯微鏡下用顯微鑷挑開窩尖，撕破圓窗膜，再輕輕將鐙骨推入卵圓窗；用3 ml移液管從蝸尖挑開處緩慢灌入4%多聚甲醛，可見淡黃色淋巴液自卵圓窗及圓窗流出，重復灌流2～3次；再將灌流后耳蝸浸泡于4%多聚甲醛(4 ℃)過夜。隨后將耳蝸放入10% EDTA脫鈣液中脫鈣5～7天；脫鈣的耳蝸用15%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液梯度脫水各2 h后，置于OTC膠中浸膠2 h，最后換用新鮮OTC膠冷凍(-20 ℃，2 h)包埋。使用冰凍切片機切片，厚度選擇12 μm，組織芯片直接貼于帶正電荷的載玻片上，最后將切片置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.6熒光染色 將耳蝸冰凍切片用PBS快速漂洗三次后，用0.25% Triton X-100處理30 min，滴加10%羊血清封閉非特異性抗原(37 ℃，2 h)，吸去血清，滴加一抗稀釋液(FATP1，1∶100；FATP4，1∶100；Anti-Myosin 7a，1∶400)，4 ℃孵育過夜，陰性對照用PBS代替一抗。吸去一抗，PBS溶液洗三次，每次5 min，滴加二抗稀釋液(Goat Anti-mouse Alexa Fluor 555，1∶400；Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 647，1∶400)及脂肪酸特異性探針(Nonpolar BODIPY Probes，0.01 mg/ml)，37 ℃避光孵育1 h，吸去二抗，PBS溶液洗三次，每次15 min，用DAPI復染細胞核10 min，PBS溶液洗去DAPI，甘油封片。每張熒光染色標本均在Leica SP8激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察FATP1、FATP4在耳蝸基底膜的表達情況以及脂肪酸的分布情況，并采集圖像。

1.7Western blot檢測 按分組與時間點隨機選取豚鼠，豚鼠麻醉后斷頭，迅速取下聽泡，用止血鉗夾掉前庭并盡量去除耳蝸周邊骨質，以一個耳蝸作為一個樣本，碾磨耳蝸，加入裂解液提取蛋白，按BCA法檢測蛋白濃度，配制分離膠為12%、濃縮膠濃度為5%。每個樣本蛋白上樣總量約30 μg，先恒壓80 V，待蛋白樣本進入到分離膠后，改為恒壓120 V，直到目的蛋白跑到合適位置(通過觀察預染蛋白Marker)。轉膜條件：全濕轉，恒壓為100 V，60～120 min。將PVDF膜取出浸泡于甲醇中15 s，加入5%牛奶(in 1X TBST)封閉液，室溫封閉2 h。將PVDF膜轉入用5%牛奶(in 1X TBST)溶液稀釋的一抗溶液中，4 ℃過夜孵育(FATP1，1∶500；FATP4，1∶1 000；Anti-Beta-actin，1∶3 000)。1X TBST洗三次，每次8 min。將洗好的膜放入5%牛奶(in 1X TBST)溶液稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液中(山羊抗兔，1∶4 000；山羊抗鼠，1∶4 000)，室溫孵育1 h。用TBST洗三次，每次7 min。取ECL超敏發光液A、B，將A、B取相同體積混勻，孵于膜上，避光反應1 min。將膜置于凝膠成像儀中進行檢測。凝膠圖像分析：將所得圖片用Image J軟件分析目的條帶灰度值。最后以FATP1(FATP4)/actin表示FATP1(FATP4)的相對表達量。

1.8統計學方法 采用Image J測量耳蝸切片熒光強度及Western blot條帶灰度值。各組計量資料以均數±標準差表示，并采用SPSS 20.0統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗統計分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1噪聲暴露前后各組ABR反應閾比較 對照組、干預組豚鼠噪聲暴露前后ABR反應閾見表1、2。噪聲暴露后6、12～24天，對照組短聲ABR反應閾無明顯差異(F=3.04，P>0.05)，但均高于噪聲暴露前(P<0.01)，表明噪聲性聾動物模型成功建立。噪聲暴露后第6、12天，干預組短聲ABR反應閾與對照組無明顯差異(t=-0.14，P>0.05)(t=1.00，P>0.05)，但第12天干預組4、8 kHzABR反應閾較對照組明顯下降(t=6.46，P<0.05)(t=3.53，P<0.05)。在噪聲暴露后24天，干預組4 kHz反應閾基本恢復到噪聲暴露前水平(t=-0.71，P>0.05)。

表1 噪聲暴露前及暴露后6、12、24天對照組豚鼠click-ABR和tb-ABR反應閾

2.2熒光染色觀察結果

2.2.1脂滴在豚鼠耳蝸的分布 正常豚鼠耳蝸內脂類物質主要分布于Corit器外側的Hensen細胞、螺旋神經節、血管紋(圖1)。

表2 噪聲暴露前及暴露后6、12、24天干預組豚鼠click-ABR和tb-ABR反應閾

2.2.2噪聲暴露前、后豚鼠耳蝸內FATP1、FATP4表達變化 噪聲暴露前FATP 1主要表達于Corti器(圖2a、c)、螺旋唇(圖2a、d)，螺旋神經節細胞、螺旋韌帶、血管紋等少量表達；噪聲暴露后第12天FATP 1主要表達于Corti器、齒間細胞，略齒細胞、螺旋突、螺旋韌帶、螺旋神經節細胞(圖2b)。熒光定量分析結果提示，FATP 1在全耳蝸表達較噪聲暴露前增加，其中在Corti器、Hensen細胞、螺旋突、螺旋韌帶表達明顯增加(P<0.01)，在螺旋神經節、血管紋表達有所增加(P<0.05)，但是在螺旋唇表達降低(P<0.05)(圖3)。

噪聲暴露前FATP 4主要表達于耳蝸Corti器及螺旋韌帶(圖4a)，但Corti外側的Hensen細胞(圖4b)、螺旋神經節、血管紋極少表達或不表達；噪聲暴露后，干預組和對照組FATP4在耳蝸的表達分布一致，主要表達于耳蝸Corti器及其外側的Hensen細胞、螺旋韌帶、螺旋神經節、螺旋唇(圖4c、d、e、f)。熒光定量分析顯示，各組FATP 4在全耳蝸(F=8.32，P<0.05)、Corti器(F=393.88，P<0.05)的表達均存在差異，其中對照組(第12天)和干預組(第24天)FATP4在Hensen細胞、螺旋唇、螺旋神經節的表達均較噪聲暴露前明顯增加(P<0.01)；FATP4在耳蝸側壁組織表達變化存在差異，干預組(第24天)FATP4在螺旋突、螺旋韌帶的表達均較噪聲暴露前及對照組(第12天)降低(P<0.05),在血管紋的表達增加(P<0.05)，對照組(第12天)FATP4在血管紋的表達較噪聲暴露前及干預組(第24天)明顯降低(P<0.01)(圖5)。

2.3Western blot檢測結果 各組豚鼠耳蝸內均有FATP1、FATP4表達(圖6a)，噪聲暴露前后FATP1和FATP4在耳蝸內的表達均有一定差異(FATP1：F=8.54，P<0.01；FATP4：F=10.79，P<0.01)。在噪聲暴露后第12天FATP1(0.53±0.01，較噪聲暴露前(0.15±0.10)明顯上調(t=-5.36，P<0.01)，干預組噪聲暴露后第24天FATP1(0.69±0.10)較噪聲暴露前(0.15±0.10)明顯上調(t=-7.60，P<0.01)，但較對照組噪聲暴露后第24天(0.49±0.26)無明顯差異(t=-1.50，P>0.05)。對照組噪聲暴露后第12天FATP4(0.67±0.09)較噪聲暴露前(0.14±0.07)明顯上調(t=-9.49，P<0.01)，噪聲暴露后干預組第24天FATP4(0.73±0.15)較噪聲暴露前(0.14±0.07)明顯上調(t=-7.20，P<0.01)，但較對照組第24天(0.601±0.27)差異無統計學意義(t=-0.85，P>0.05)(圖6b)。

3 討論

聽覺感受器細胞(外毛細胞和內毛細胞)由內柱、外柱、Deiter、Hensen和Claudius等支持細胞支撐坐落在耳蝸內基底膜上，其中有“耳蝸放大器”[9]之稱的外毛細胞主要感受聲音(85%的微音電位來自外毛細胞)，一方面將機械的聲波轉換為膜電位，另一方面在膜電位形成的同時使外毛細胞收縮伸展，產生主動放大作用，使聲音放大，具有雙向放大作用，這是大量耗能的過程[3]。同樣具有舒縮功能的心肌細胞所需的大量能量主要由脂肪酸β-氧化提供[8]，所以，外毛細胞極有可能存在與心肌細胞相同的能量代謝方式。而耳蝸內淋巴中葡萄糖濃度僅為0.6 mmol/L，鼓階外淋巴葡萄糖濃度為3.6 mmol/L，前庭階外淋巴葡萄糖濃度為3.8 mmol/L[9,10]，提示淋巴液中的糖可能不足以給耳蝸外毛細胞舒縮及時提供足夠的能量支持。因此，早在二十世紀五十年代就有學者提出在聽覺器官受刺激的過程中，為了獲得營養和氧氣，毛細胞必須有一個高度發達的營養輔助系統，其中含有大量脂滴并且能提供大量脂肪酸[3]的Hensen細胞可能是主要營養細胞之一[11]。

既往研究[12]發現小鼠耳蝸有脂肪酸結合蛋白(fatty acid-binding prote，FABP)表達，其中心臟型脂肪酸結合蛋白[H(heart-type)-FABP]主要表達于耳蝸的外柱細胞、內柱細胞、外指細胞，腦型脂肪酸結合蛋白[B(Brain-type)-FABP]主要表達于耳蝸的Hensen細胞、內指細胞、內柱細胞。雖然尚不清楚FABP在不同耳蝸支持細胞群中的功能，但極可能是FABP通過影響支持細胞的脂肪酸環境來調控毛細胞的功能。Suzuki等[13]通過觀察FABP3(H-FABP)基因敲除小鼠的聽力變化特點，沒有證明FABP 3在耳蝸的功能，僅發現耳蝸功能還受其他FABP的代償作用影響，而沒有表現出聽力損失；表明FABP可能是調節耳蝸功能的重要蛋白因子。而FATP是促進長鏈和極長鏈脂肪酸進入細胞的完整跨膜蛋白[14]，同樣是決定脂肪酸能否進出細胞參與一系列生物學反應的關鍵蛋白家族之一[15]。細胞及組織的脂肪酸代謝水平則受FATP、FABP等蛋白因子的共同影響。

本研究初步驗證了豚鼠耳蝸脂類物質主要分布于基底膜外側的Hensen細胞、螺旋神經節、血管紋。噪聲暴露前，FATP 1主要表達于Corti器、齒間細胞、略齒細胞；FATP 4主要表達于耳蝸Corti器及螺旋韌帶，但Corti器外側的Hensen細胞極少表達或不表達；提示FATP1、FATP4在正常豚鼠耳蝸內的分布存在組織特異性。文中結果顯示噪聲暴露前后FATP 1和FATP 4在豚鼠耳蝸的表達均存在明顯差異，在噪聲暴露后第12天時，對照組FATP1、FATP4表達較正常對照的豚鼠顯著增加(P<0.05)，而之后FATP1、4均維持在一定的高水平，提示噪聲損傷可提高耳蝸內FATP1和FATP4的表達。

從文中結果看，噪聲及苯扎貝特干預可使FATP 1和FATP 4在耳蝸內的表達變化存在部位差異，對照組FATP1在Corti器、Hensen細胞、螺旋突、螺旋韌帶表達較噪聲暴露前明顯增加；而對照組(第12天)和干預組(第24天)FATP4在Hensen細胞、螺旋唇、螺旋神經節的表達均較噪聲暴露前明顯增加，并且FATP4在耳蝸側壁組織表達變化存在差異，即干預組(第24天)FATP4在螺旋突、螺旋韌帶的表達均較噪聲暴露前及對照組(第12天)降低，在血管紋的表達增加，而對照組(第12天)FATP4在血管紋的表達較噪聲暴露前及干預組(第24天)明顯降低。血管紋含有豐富的血管組織，有旺盛的物質轉運、能量轉換等功能[16]，苯扎貝特是提高脂肪酸轉運蛋白表達、促脂肪酸β-氧化的藥物[6]，在給予噪聲暴露的同時給予苯扎貝特干預，很可能通過分別提高FATP1以及FATP4在上述耳蝸局部組織的表達，并且通過FATP 1和FATP 4的相互代償、補足，共同促進血管紋和/或Hensen細胞向毛細胞轉運脂肪酸，為毛細胞的主動運動提供能量物質，從而防止噪聲性聽力損失。但是對照組(第12天)FATP4在血管紋的表達較噪聲暴露前明顯降低，很可能造成耳蝸內脂肪酸轉運失代償而不能維持耳蝸毛細胞在噪聲暴露下的正常功能，從而造成聽力損失。豚鼠耳蝸內Hensen細胞脂滴主要分布于耳蝸第三、四回基底膜(低中頻聽力)，可以提供豐富的脂肪酸，但是Hensen細胞脂滴在第一、二回基底膜(高頻聽力)分布較少[3]，這可能也是本研究中干預組在噪聲暴露后第12天聽力開始恢復并且4、8 kHz聽力損失恢復較對照組快、而對照組及干預組16 kHz聽力難以恢復的重要原因。

文中結果表明噪聲暴露可提高FATP1和FATP4在豚鼠耳蝸局部組織的表達水平，從而促進耳蝸內脂肪酸轉運；促脂肪酸代謝藥物(苯扎貝特)干預可進一步改變FATP4在耳蝸的表達分布，從而在一定程度上防止噪聲性聽力損失或促進噪聲性聽力損失恢復。本研究為進一步探索耳蝸脂肪酸代謝調節耳蝸功能的機制提供了實驗依據，被轉運的脂肪酸具體通過何種機制改善噪聲性聽力損失還需進一步研究。