下食管括約肌球囊擴張建立咽喉反流性疾病兔模型△

孫喆喆 王剛，2# 黃鑫 趙曉波 王磊 韓浩倫 李保衛 劉紅丹 李連勇 吳瑋，2

咽喉反流性疾病(laryngophyngeal reflux disease,LPRD)是指胃內容物反流至食管上括約肌以上部位，引起一系列癥狀和體征的總稱[1]。LPRD發病率高，與多種耳鼻咽喉科疾病相關[2]，是近年來的研究熱點。國外研究顯示LPRD的發病與抗反流屏障、食管廓清能力及靶器官的敏感度等多種因素有關[3]，但目前該病的發病機制尚未完全明確，建立安全有效的動物模型對該病的發病機制及治療方法的研究顯得尤為必要。目前內源性動物LPRD模型的造模機制主要是通過破壞抗反流屏障，尤其是下食管括約肌(lower esophageal sphincter, LES)的結構和功能，導致胃內容物反流至上氣道，從而引發LPRD[4～6]。本研究通過下食管括約肌球囊擴張法建立新西蘭兔的LPRD模型，并通過檢測擴張前后LES壓力、咽喉及食管pH值變化、喉鏡下反流體征及組織病理學改變對模型進行驗證，旨在為進一步研究LPRD提供一種安全、有效、微創的動物模型，現報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 選擇5月齡雌性新西蘭白兔18只(購自科宇動物養殖中心，北京)，體重2.5～3.0千克，通過體重排序后，按隨機數字表隨機分為實驗組10只和對照組8只，所有動物飼養于自動控制明暗環境中，恒溫恒濕，每日喂食兩次，自由飲水，適應性飼養3天后開始實驗。實驗組行下食管括約肌擴張術，對照組進行假擴張，單純置入球囊，不進行注水擴張。所有實驗動物的處理協議遵守嚴格的批準程序且與國家實驗動物使用指南一致，本研究獲得戰略支援部隊特色醫學動物倫理委員會批準。

1.2下食管括約肌擴張術建立LPRD兔模型 動物術前禁食24小時，禁水6小時，10%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔麻醉后固定于操作臺，經口置入Hercules擴張球囊(美國Wilson-Cook Medical公司，最大擴張直徑1.5 cm，有效擴張長度5.5 cm)。通過食管測壓確定LES距門齒的距離，氣囊沿導絲插入食管內，使氣囊中心位于測定位置，緩慢向球囊內注水，注水過程不少于30秒，最終壓力維持在1 atm，維持5 min，重復擴張2次，間隔3 min，此兩次擴張記為一輪擴張。擴張過程中對動物進行心電、血氧飽和度監測，若出現心率、血氧異常下降立即中止操作，術后禁食24小時，進水不限。依據下文pH監測結果判斷擴張建模是否有效，對于第一輪擴張無效的實驗組動物進行第二輪擴張。

1.3下食管括約肌測壓及定位 擴張前1周及擴張后2周行下食管括約肌測壓。選用荷蘭MMS公司的定制單導聯固態食管測壓導管，動物術前禁食24小時，禁水6小時，麻醉后固定，校正儀器。經口置入測壓導管，先將電極位置向下放至胃內，此時壓力約10 mmHg，且曲線平直，無呼吸波。緩慢上提電極，直至出現規律性壓力升高，在此時處于門齒處的導線上做標記，記為LES下緣，繼續緩慢上提可見壓力繼續升高，每個位置保持3個收縮周期，直至壓力降低到低于胃內壓且存在規律呼吸波，記為LES上緣。通過儀器自帶軟件可以算出LES平均靜息壓，并可根據導線標記位置，準確定位LES距離門齒的距離。擴張后2周再次行LES測壓，比較擴張前后LES壓力的變化。

1.4咽喉及食管下段pH值監測 于球囊擴張前1周和擴張后2周進行咽喉及食管下段pH值監測，觀察咽喉反流及胃食管反流情況。動物麻醉后固定，經口置入2根Restech DX-pH檢測電極(美國Respiratory Technology公司)，進行咽部及食管下段pH值同步監測，監測電極使用前均在pH 4.0和pH 7.0校準液內校準。咽部電極放置在下咽部，食管電極放置在此前測壓定位的LES上緣上3 cm處，監測時間為2小時，通過DX-pH檢測儀的自帶軟件進行數據分析，記錄pH<5的酸反流事件百分比、反流事件數、反流最長時間，參考人類LPRD診斷標準[7, 8]，2小時內觀察到咽喉pH<5的反流事件≥1次，視為造模成功，經兩輪擴張仍未達到標準視為造模失敗。

1.5喉鏡檢查和反流體征評分 擴張前1周、擴張后2周及擴張后8周行喉鏡檢查并拍照，目前并無兔的反流體征評分系統，所以參考Belafsky等[9]提出的人類反流體征評分(reflux founding score，RFS)對其喉部圖像的各項體征(聲門下水腫、喉室消失、紅斑/充血、聲帶水腫、彌漫性喉水腫、后聯合增生、肉芽腫、喉內黏稠黏液附著)進行評分。

1.6病理檢查 擴張后8周所有實驗動物麻醉后，行股動脈切開放血法處死，取喉部黏膜及食管下段組織，置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規HE染色后，光鏡觀察組織學改變。

2 結果

2.1LPRD兔模型造模結果 實驗組10只動物中LPRD造模成功8只，失敗1只，死亡1只，經解剖發現死因為肺部感染；造模成功的8只動物中6只為一輪擴張后建模成功，2只為二輪擴張后建模成功。對照組8只，存活7只，死亡1只，死因為腹瀉。

2.2下食管括約肌測壓結果 實驗組建模成功的8只動物，LES中點距離門齒24.2±0.8 cm，LES長度0.8±0.3 cm，擴張前LES壓力28.0±5.6 mmHg，擴張后LES壓力17.2±3.3 mmHg。對照組存活的7只動物，LES中點距離門齒24.1±0.7 cm，LES長度0.9±0.2 cm，擴張前壓力27.6±4.7 mmHg，擴張后壓力23.3±2.4 mmHg。實驗組擴張后LES壓力較擴張前顯著降低(t=6.19，P=0.001)，且擴張前LES收縮波規整，擴張后收縮波紊亂不規整(圖1)，對照組假擴張前后LES壓力無顯著統計學差異(t=1.36，P=0.246)。

2.3喉鏡RFS評分結果 實驗組擴張前1周RFS評分3.1±1.2分，擴張后2周為3.6±1.4分，擴張后8周為8.6±2.5分，對照組擴張前1周為2.4±1.5分，擴張后2周為2.6±1.3分，擴張后8周為2.8±0.8分，實驗組擴張前與擴張后兩周的RFS評分無統計學差異(P=0.482)，但擴張前與擴張后8周有統計學差異(P=0.005)。實驗組擴張后主要表現的LPRD體征為聲門下水腫、喉部黏液附著、彌漫性喉部水腫等，其中1例動物出現聲突肉芽腫。對照組擴張前后的喉鏡圖像基本正常，擴張后2周及8周較擴張前評分差異無統計學意義(P=0.815，P=0.717)(圖2)。

2.4咽喉pH值監測結果 建模成功的8只實驗組動物擴張前后咽喉2 h pH檢測結果(圖3)示：擴張前1周實驗動物pH<5的酸反流時間百分比(%)、反流事件數(次)、反流最長時間(s)分別為：0(0,0)、0(0,0)、0(0,0)，擴張后2周分別為：17.5(8.2,29.4)、3(1,5.5)、17.2(10.2,30.8)，擴張后較擴張前增加，差異有統計學意義(均為P<0.001)。對照組動物擴張前1周pH<5的酸反流時間百分比(%)、反流事件數(次)、反流最長時間(s)分別為：0(0,0)、0(0,0)、0(0,0)，假擴張后2周分別為：0(0,3.1)、0(0,0.5)、0(0,3.7)，假擴張前后各項監測數據差異無統計學意義(均為P>0.05)，擴張后2周實驗組各項反流指標較對照組均有提高，差異有統計學意義(均為P<0.01)。

2.5食管下段pH值監測結果 擴張前后食管下段2 h pH檢測結果示：實驗組動物擴張前1周監測酸反流時間百分比(%)、反流事件數(次)、反流最長時間(s)分別為: 0(0,0.7)、0(0,1)、0(0,1.2)，擴張后2周分別為：23.1(4.8,49.5)、3(1,6)、25.9(11.5,56.8)，較擴張前增加，差異有統計學意義(均為P<0.05)。對照組動物擴張前1周pH<5的酸反流時間百分比(%)、反流事件數(次)、反流最長時間(s)分別為：0(0,0.6)、0(0,1)、0(0,1)，假擴張后2周分別為：0(0,2.7)、0(0,1)、0(0,2.1)，假擴張前后各項監測數據差異無統計學意義(均為P>0.05)。擴張后實驗組較對照組食管各項反流指標均有提高，差異有統計學意義(均為P<0.01)。

2.6病理檢查結果 對照組喉部及食管黏膜無明顯炎癥表現，實驗組喉部及食管黏膜均可觀察到不同程度的炎癥，喉部黏膜主要表現為淋巴細胞、漿細胞浸潤性慢性炎癥，伴間質水腫、腺體增生；食管黏膜表現為淋巴細胞浸潤性慢性炎癥，局部可以觀察到鱗狀上皮角化不全(圖4)。

3 討論

LPRD是近年來研究的熱點，選擇和建立有效的動物模型對該病的機制研究十分重要。LPRD的動物研究有活體研究和離體研究，活體研究動物模型多借鑒于胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)的動物模型，建立方法主要是通過內源性和外源性兩種方法[3, 10]。外源性方法主要是通過向實驗動物咽喉部噴灑或者灌注胃酸、胃蛋白酶、膽鹽中的一種或多種物質從而構建模型，此方法簡單易行且動物存活率較高，但并不符合反流的病理生理，且灌注液與真實反流物并不完全相同，無法完全揭示LPRD的發生發展。內源性方法主要通過手術改變胃腸道解剖或者破壞反流屏障，造成胃腸內容物反流，目前常用的建模方法包括LES切開或切除術[4]、LES擴張加上食管括約肌(upper esophageal sphincter, UES)支架植入[5]、幽門或十二指腸縮窄術[6]等。內源性方法構建的動物模型更加符合反流的病理生理，但是手術難度較大，對動物創傷較大，動物存活率較低。另外，國內有學者探索通過病因學進行建模，進行了睡眠剝奪和高脂飲食誘發LPRD的動物模型研究[11]，不失為一種另辟蹊徑的好方法，不過這種方法建模后必然混雜了睡眠剝奪和高脂飲食兩種因素，對結局指標與LPRD因果關系判斷有一定影響。

LPRD內源性動物模型與GERD模型的互相借鑒源于兩病在病因學上有所重疊，均涉及反流屏障的完整性、反流的頻率和持續時間、反流物的酸度、食管廓清率、胃排空率、黏膜屏障的完整性、靶器官的敏感性等因素，其中LES是反流屏障的重要組成部分，既往研究顯示LES一過性松弛不但是GERD的重要病因，同樣也是LPRD的重要發病機制[3, 12]，LES松弛后，氣態或氣液態混合反流物到達食管時，可引起食管壁的迅速擴張，繼而引起UES的松弛反射，從而利于反流物反流至咽喉，引起LPRD[13, 14]。本課題組的研究[15]也證實LPRD患者中胃食管閥瓣區的松弛程度與RFS評分存在相關性，提示LES的松弛度與LPRD病情嚴重程度相關。既往的動物研究顯示兔模型中即使不對UES進行處理，單純切除LES造成的慢性的胃食管反流也可以引起咽喉反流[16]。但內源性方法構建LPRD模型存在手術難度大，動物創傷大，動物存活率低等缺點，近年來有研究顯示食管括約肌球囊擴張法可以安全有效地構建GERD動物模型[17]，此方法通過球囊擴張，使部分LES括約肌纖維拉長甚至斷裂，造成LES松弛，而生理情況下胃內壓高于食管內壓，從而導致胃食管反流的發生，繼而可能引發LPRD。此方法的難點為LES的準確定位和適度擴張，既往研究多是通過開腹直視橡皮筋固定球囊位置避免球囊松脫移位[18]，增加了造模難度和動物死亡率。

本研究借鑒了LES球囊擴張法，并予以改進完善。鑒于此法中LES定位及球囊固定的難點，本研究使用食管測壓準確定位每只實驗動物的LES位置，避免了因球囊位置不當導致的食管破裂及LES擴張不足。此外本研究選用專用的消化道擴張球囊，其有效擴張長度達5.5 cm，有效擴張長度內球囊呈柱狀，不易發生移位，預實驗中切開食管觀察見球囊可對LES進行全長擴張且無明顯移位。本球囊有效擴張直徑可選1.0 cm、1.5 cm、2.0 cm，經預實驗確定1.5 cm直徑的球囊可以對5月齡實驗用新西蘭白兔的LES進行有效擴張，擴張時注意球囊加壓一定要緩慢均勻，加壓過程不小于30秒；擴張完成后食管下段呈半透明狀，可使部分平滑肌斷裂或破壞，造成食管下段松弛或失去張力，擴張后2周食管測壓仍可觀察到LES靜息壓較擴張前顯著降低，且收縮波紊亂不規整，證實了經此法LES得到了有效擴張。另外，本研究發現雖然擴張前動物禁食水，但擴張球囊取出時，仍會帶出少量胃內食物殘渣，此時應注意使用負壓吸引器將咽喉部及食管上段的食物殘渣吸除干凈，避免誤吸導致動物死亡。因為兔的咽部細小，較易發生喉痙攣及誤吸，本研究中雖對食物殘渣進行了徹底吸引，仍有1只動物因肺部感染死亡。

本研究結果顯示對實驗用新西蘭白兔單純LES的有效擴張即可造成LPRD，且伴有GERD；通過LES測壓可見，擴張后LES多出現較嚴重的松弛改變，且收縮變得不規律；pH值監測驗證建模后實驗動物咽喉及食管各項反流指標均較建模前顯著提高，病理檢查顯示實驗組喉部黏膜出現淋巴細胞浸潤、間質水腫、腺體增生等慢性炎癥表現；說明此方法通過對LES的準確定位和有效擴張可建立兔的LPRD模型，且操作相對簡便，安全有效，對動物造成創傷較小，實驗組僅死亡1只，且無食管破裂發生，符合實驗動物倫理及3R原則。本研究建模成功率為80%(8/10)，符合LPRD病理生理過程，適合長期觀察反流所致的氣道黏膜損傷。由于反流物質引起的上呼吸道炎癥是一個慢性過程，本研究中觀察到造模2周后實驗動物的喉鏡評分較建模前無顯著差異，而8周后喉鏡下可見典型的LPRD的相關體征，如聲門下水腫、喉部黏液附著、喉部彌漫性水腫，甚至有1只實驗動物出現聲突肉芽腫，提示LPRD動物實驗的觀察時間不宜過短。因此，LPRD建模過程盡量選用微創的造模方法，這樣可以保證動物長時間存活，便于觀察慢性反流所致的病理改變。

綜上所述，本研究通過食管測壓定位LES，使用球囊擴張的方法建立了LPRD的動物模型，經LES測壓、pH監測、喉鏡下表現及病理驗證了模型的有效性，為LPRD的研究提供了一個微創、安全、有效的動物模型，并為該病機制研究開拓了新的思路。本模型與目前絕大多數研究LPRD的動物模型一樣，借鑒于GERD動物模型，實驗動物在出現咽喉反流的同時必然伴發較嚴重胃食管反流，而臨床中的LPRD患者往往不伴有典型的GERD[19]，如何構建單純LPRD模型是未來的研究難點和方向。