利用轉錄組學數據探究阿爾茨海默病與食管癌的關聯

殷曉莎 田肅巖

(吉林大學第一醫院臨床研究部，吉林 長春 130021)

阿爾茨海默病(AD)是一種常見的神經退行性疾病，多見于70歲以上人群，占癡呆癥患者的60%～80%〔1〕。食管癌(EC)的死亡率在癌癥相關死亡中排名第六，發病率在所有癌癥中排名第七〔2〕，是一種常見的惡性消化道癌癥。老年食管癌患者數量不斷增加，且食管癌在老年人群中預后更差〔3〕。

一些研究為AD和癌癥之間的關聯提供了流行病學、細胞水平及分子水平的證據。Ma等〔4〕的meta分析將隊列研究中人群的年齡、性別等干擾因素進行調整后發現，相較于未罹患AD的人群，罹患AD的人群癌癥風險降低42%；相較于未罹患癌癥的人群，罹患癌癥的人群發生AD風險降低37%。Yarchoan等〔5〕研究也表明，與未罹患癌癥人群相比，罹患癌癥人群AD的發生率顯著降低，并檢測了罹患癌癥與未罹患癌癥的人腦內神經原纖維纏結(NTF)和β-淀粉樣蛋白(Aβ)水平，結果顯示Aβ水平相似，但罹患癌癥的人腦內NTF明顯低于未罹患癌癥的人群。AD和癌癥都隨著年齡增長，發病率快速增高〔6,7〕，AD和癌癥之間存在復雜的生物學關系。AD和癌癥可看作是衰老的不同表現，AD中神經元進行性死亡標志著神經元變性，細胞不受控制的增殖是癌變的特征〔8〕。AD和癌癥中存在相同基因發生不同方向的失調，如已知的腫瘤抑制基因P53在AD中上調，在癌癥中下調〔9〕，死亡蛋白激酶(DAPK)1在AD中上調，在癌癥中失活〔10〕。

通過查閱文獻發現AD和EC之間存在共享分子。氧化應激標志物4-羥基壬烯醛(4-HNE)可促進AD中Aβ沉積、tau蛋白磷酸化〔11,12〕，它在EC上皮中的含量相較于正常食管上皮顯著增多，且隨癌癥進展而增加〔13〕；miR-21可抑制AD中Aβ表達〔14〕，它在EC晚期顯著升高，能誘導癌癥細胞生長和侵襲〔15〕。這些證據表明AD和EC之間可能存在關聯，但仍需進一步探索。隨著基因芯片和二代測序技術的發展，對高通量轉錄組學數據進行大數據分析，能快速發現不同疾病共享的基因和通路，進而探究不同疾病之間潛在的生物學關聯。本研究利用基因表達譜數據，通過識別AD和EC共享的基因和通路來探索二者間關聯。

1 材料方法

1.1數據來源和處理 AD數據集對應基因表達綜合數據庫(GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中的GSE48350數據集，該數據集的檢測芯片為Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。該數據集包含58個健康人的173個腦組織和29例AD患者的80例AD腦組織，這些腦組織分別來自大腦的4個區域(海馬、內嗅皮質、上額葉皮層和中央后回)。EC數據集來自癌癥基因組圖譜(TCGA)中食道癌(ESCA)隊列的RNA-seq數據，包括161例腫瘤組織和11例癌旁正常組織。

AD數據集(GSE48350)已經魯棒多陣列平均(RMA)法背景校正和log2轉化。使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片對應的注釋包hgu133plus2.db進行探針集和基因名的轉化，如果有多個探針集對應一個基因，則保留平均表達量最高的探針，EC數據集來自TCGA中的EC隊列。AD和EC數據集測序方法、平臺不一樣，所包含的基因不一樣，為保證AD和EC數據集中含有相同的基因，事先將兩個數據集內的基因取交集得到重疊的16 379個基因。

采用邦弗羅尼-霍克伯格(BH)法〔16〕對P值進行多重檢驗校正，調整后P值為錯誤發現率(FDR)。統計分析均在R語言(https://www.r-project.org/)3.6.1版本中進行。

1.2統計方法

1.2.1篩選AD和EC的差異表達基因(DEGs) 在R語言環境下調用limma包，對大腦4個區(海馬、內嗅皮質、上額葉皮質、中央后回)AD組與健康組基因表達值分別進行穩健t檢驗，設置差異表達基因的閾值為|log2FC|≥1，FDR<0.01，如果有基因在兩個及以上腦區差異表達則取最小的FDR；對EC的癌癥組和癌旁組的基因表達值進行穩健t檢驗，設置DEGs閾值為|log2FC|≥1，FDR<0.01獲得EC的DEGs。在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖，使用ggplot2包繪制火山圖。

在R語言環境下調用tinyarray包選取基因表達值的最佳截斷點，并利用最佳截斷點對共享基因的表達值分組(高、低表達組)，對兩組生存曲線進行log rank檢驗。KM生存曲線圖使用survminer包和ggplot2包繪制。

1.2.2對AD和EC DEGs的富集分析 基因本體論(GO)功能注釋是進行大規模功能富集研究的常用方法，GO數據庫對基因的描述包括3個方面，分別為生物學過程(BP)，分子功能(MF)和細胞組分(CC)。 京都基因與基因組百科全書(KEGG)是一個廣泛使用的數據庫，它存儲和基因組、生物途徑、疾病、化學物質和藥物有關的大量數據。富集分析是一種可以把GO和KEGG數據庫中的功能和通路等進行整合計算的算法。將篩選出的AD和EC的DEGs分別在clusterProfiler〔17〕包中進行GO〔18〕功能注釋和KEGG〔19〕通路富集，富集分析閾值為counts≥2，FDR<0.05。

2 結 果

2.1AD與EC的差異表達基因 AD和EC DEGs的重疊(AD 125個，EC 2 395個)，得到19個共享基因包括白細胞分化抗原(CD)44、生長抑素(SS)T、CD86、泛素結合酶E2T(UBE2T)、著絲粒蛋白(CENP)W等。在AD中19個基因中有6個基因上調，13個基因下調；在EC中19個基因有11個基因上調，8個基因下調，見表1。AD和EC DEGs見圖1標記出的19個共享基因。

表1 AD和EC 19個共享基因表達

2.2AD和EC DEGs富集分析 AD的DEGs富集分析得到165個GO注釋和6個KEGG通路；對EC的DEGs進行富集分析得到1 371個GO注釋和38個KEGG通路。最終，AD和EC沒有重疊的KEGG通路，但有8個重疊的GO注釋，分別為內吞作用的調節、肽基酪氨酸磷酸化的正調控、細胞器定位的建立、神經元死亡、神經元死亡的調節、腫瘤壞死因子超家族細胞因子產生的調控、受體復合體、谷氨酸能突觸，見表2。

2.3AD與EC相關聯基因CD44、CD86在AD與EC中均呈高表達，通過繪制CD44與CD86高、低表達組的KM生存曲線，對預后進行評估發現CD44表達值高的組預后差，而CD86高低表達組生存曲線無顯著差別，表明CD86不具有預后價值。見圖2。

圖1 AD和EC DEGs火山圖

表2 AD和EC共享的GO富集分析

圖2 CD44和CD86高、低表達組的KM生存曲線

3 討 論

目前還沒有研究利用轉錄組學數據探究AD和EC間的關聯，本研究通過對基因表達譜數據分析，識別AD和EC之間共享的異常表達基因和通路，找出將兩種復雜疾病聯系在一起的共享機制，探索兩種疾病的關聯情況。本研究得到的共享基因中，有些炎癥相關基因已明確涉及AD和EC的發病，如CD44、CD86和CHGA，提示炎癥反應可能是將兩種疾病關聯起來的共同機制之一。CD44有20個外顯子，僅含有組成型外顯子的CD44轉錄產物為標準CD44(CD44S)，EC上皮中CD44S表達增高與E-鈣黏著蛋白在上皮-間質轉化中缺失有關〔20,21〕，這種蛋白的缺失降低了組織內細胞的黏附力，使EC細胞轉移和侵襲能力增強；星形膠質細胞可清除AD腦組織中的Aβ，CD44是星形膠質細胞形成過程中的重要黏附分子，在AD腦內，CD44陽性的星形膠質細胞彌漫性急劇增加〔22〕，可能Aβ的刺激動員了星形膠質細胞發生炎癥反應，CD44因此表達升高。上述研究均表明CD44在AD和EC中呈現高表達，與本研究結果一致，通過對CD44在EC中的預后分析，發現CD44表達值高的組預后差，與Okamoto等〔23〕研究結果一致。

CD86是促炎性M1表型的標志物，Aβ可促進小膠質細胞激活產生促炎性M1表型，促進炎癥和組織損傷，AD中存在大量M1表型的小膠質細胞，CD86也處于高表達狀態〔24〕，這支持本研究中CD86在AD中上調。CD86是樹突細胞表面分子，它的低表達使得樹突細胞呈遞抗原的功能下降，癌細胞更容易逃脫免疫監視。楊文鋒〔25〕通過RT-PCR檢測了EC組織中CD86的mRNA水平，發現其相對于正常對照組表達降低，推測這可能是炎癥因子(轉化生長因子和白細胞介素10)導致CD86表達降低。本研究中CD86顯示在EC中上調，與楊文鋒等〔25〕的結果不一致，可能是由于測量人群的異質性或基因多態性〔26〕導致，需要進一步設計實驗驗證。

嗜鉻粒蛋白(CHG)A是一種可溶性糖蛋白，與激素和神經肽一起存儲在內分泌細胞的分泌顆粒中，是神經內分泌腫瘤的分化標志物，參與腫瘤血管生成和腫瘤生長調節〔27,28〕。突觸障礙可能在AD的病理生理中起關鍵作用，Lechner等〔29〕通過免疫組化實驗發現，約40%的CHGA免疫陽性斑塊和細胞外沉積物彌漫著活化的小膠質細胞，提示CHGA可能是AD中神經元、神經膠質和炎性機制之間的介體。

本研究還發現在共享基因中SST與激素分泌有關，提示激素分泌也可能是AD和EC中共享的潛在機制。SST廣泛存在于下丘腦、大腦皮層、胃腸道中，已知它通過與高親和力的G蛋白耦聯生長抑素受體結合而抑制許多次要激素的釋放，在共享的GO注釋中可發現，AD和EC的DEGs同時被富集在激素轉運、激素分泌、調節介素分泌這幾個激素相關的生物學功能上，提示激素可能在AD和EC中有關鍵作用。SST是Aβ1-42選擇性最強的結合物，干擾Aβ原纖維化并促進Aβ裝配體的形成〔30〕。Jin等〔31〕通過實時甲基化特異性聚合酶鏈反應對EC患者中SST的超甲基化進行檢測，發現在食管腺癌中，天然未甲基化中的SST mRNA水平顯著高于天然甲基化中的SST mRNA水平，且在鱗癌和腺癌中，SST的甲基化頻率和標準化甲基化均顯著高于正常對照組，表明SST的高甲基化和EC發生有關。

綜上，AD和EC這兩種疾病共享相同的差異表達基因，但它們在兩種疾病中的差異表達方向有的相同，有的相反，這些共享的基因和通路涉及的炎癥反應(如CD44、CD86)、激素釋放(如SST、GO:0030100)等生物學過程可能是將AD和EC聯系在一起的機制。AD和EC之間可能存在關聯，關于兩種疾病關聯研究的證據還不充分，需要大型實驗進行驗證。本研究從轉錄組學水平，利用生物信息學的方法對AD和EC的關聯進行探索，提供了兩種疾病關聯研究的新視角。