苦參凝膠對大鼠細菌性陰道炎陰道黏膜SDF-1/CXCR4軸的影響

向麗 曹麗蓉 王中顯 黃浩梁 王平

(武漢市第一醫院婦產科，湖北 武漢 430000)

細菌性陰道炎在婦科臨床中為常見病及多發病，大多是細菌感染所致〔1〕，患者出現外陰瘙癢、白帶增多、陰道分泌物異常等癥狀，病情嚴重者會導致宮頸炎、附件炎等并發癥，嚴重影響婦女的身心健康〔2〕?？鄥⒛z的有效成分主要為苦參堿，是純中藥制劑，可殺蟲止癢、清熱利濕〔3〕，臨床中常用來治療慢性婦科炎癥，可恢復陰道內環境，改善其微生態平衡，進而減輕細菌性陰道炎患者的臨床癥狀，降低其復發率〔4〕?；|細胞衍生因子(SDF)-1是一種炎性趨化因子，CXC趨化因子受體(CXCR)4是其受體，在多種細胞和組織中廣泛表達，介導細胞募集、遷移、增殖等生理活動〔5〕，另外研究發現SDF-1/CXCR4軸在炎癥反應中起到重要的調節作用，外源性SDF-1可引起骨性關節炎，下調SDF-1/CXCR4表達，可減輕炎癥反應，延緩牙齦卟啉單胞菌誘導的牙周炎病情進程〔6〕，因而推測SDF-1/CXCR4軸可介導細菌性陰道炎。研究表明，苦參堿可抑制人胃癌細胞SGC-7901中CXCR4 mRNA表達，并誘導其凋亡〔7〕，在對HL-60細胞體外遷移研究中發現，復方苦參注射液可通過上調miR-146a表達而抑制SDF-1/CXCR4信號通路，進而減弱其遷移能力〔8〕，但在細菌性陰道炎中，SDF-1/CXCR4的表達及苦參凝膠對其的作用，目前還未有明確報道，本文探討苦參凝膠處理對細菌性陰道炎大鼠陰道黏膜SDF-1/CXCR4軸的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級Wistar大鼠購自長沙市天勤生物技術有限公司，生產許可證號SCXK(湘) 2019-0013，使用許可證號SCXK(湘) 2019-0013，雌性，體重180～220 g，飼養于醫院動物中心，動物房溫度設置為25℃，相對濕度設置為55%，噪音低于80 dB，自然光照、氨濃度小于20 ppm，氣流速度10～25 cm/s，每小時通風換氣8～12次，自然飲食、飲水，定期更換墊料，清洗、消毒鼠籠。

1.2主要藥品及試劑 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌(批號：25923、25922、27853)購自美國ATCC公司；苦參凝膠(國藥準字 Z20050058，每支5 g，批號：180127)購自貴陽新天藥業股份有限公司；氧氟沙星栓(批號：180312)購自江西吉安三力制藥有限公司；營養肉湯培養基(批號：BS1007)購自青島捷世康生物科技有限公司；血瓊脂培養基(批號：WD-0131)購自上海榕柏生物技術有限公司；羊抗兔二抗、兔源anti-CXCR4一抗、兔源anti-GAPDH一抗、兔源anti-SDF-1一抗、大鼠白細胞介素(IL)-6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(批號：ab150077、ab197203、ab181602、ab9797、ab100772、ab100785)購自Abcam公司；SDF-1、CXCR4、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)試劑盒(批號：9108、9014、9519)購自Takara公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(批號ZY7070)購自上海澤葉生物科技有限公司；RIPA裂解液(批號GL1476)購自北京百奧萊博科技有限公司；BCA試劑盒(批號：LCB004)購自上海榕柏生物技術有限公司。

1.3主要實驗儀器 DNA合成儀(型號MerMade-192E)購自北京梓熙生物科技有限公司；多功能酶標儀、熒光定量PCR儀(型號VARIOSKANLUX、QuantStudio 3)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；轉膜儀、蛋白電泳儀(型號：Trans-Blot SD、1659001)購自美國Bio-Rad公司；實驗室教學生物顯微鏡(型號Eclipse E200)購自日本尼康公司；石蠟切片機(型號RM2235)購自德國Leica公司；化學發光凝膠成像系統(型號JS-1090P)購自上海培清科技有限公司。

1.4方法

1.4.1細菌性陰道炎大鼠模型建立及分組給藥 感染菌液的制備〔9〕：將葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌3種菌株復蘇后以無菌營養肉湯培養、傳代，并配制濃度為2.0 × 109個/ml的菌液，接著將3種菌液按1∶1∶1的比例混合成感染菌液備用。

參照文獻〔10〕：以45 mg/kg的劑量腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，在無菌操作臺中摘除大鼠雙側卵巢，術后第4天開始每天以10 mg/kg的劑量皮下注射苯甲酸雌二醇，持續4 d后，以60 mg/kg的劑量皮下注射氫化可的松注射液，隔日1次，持續3 d，復制大鼠免疫功能低下模型。2 d后將50 μl感染菌液注入大鼠陰道內，提起大鼠尾部停留約2 min，防止菌液溢出，1 d后以相同方法再感染1次，然后隔日交替皮下注射苯甲酸雌二醇、氫化可的松注射液各1次，建模結束后觀察大鼠外陰情況，若呈現腫脹發紅，并有白色分泌物滲出，取少量分泌物涂布在血瓊脂培養基，在37℃下培養，72 h后肉眼觀察到培養基上分布有大小不等的菌落，則表明模型建立成功，共成功建立模型大鼠60只，隨機分為模型組、氧氟沙星栓劑(0.02 g/kg)組、苦參凝膠低(0.25 g/kg)、中(0.50 g/kg)、高(1.00 g/kg)劑量組，每組12只，另取12只設為假手術組，只進行手術操作，不摘除卵巢，大鼠陰道內注入50 μl無菌營養肉湯，其他操作同模型組。參照文獻，苦參凝膠低、中、高劑量組分別以0.25、0.50、1.00 g/kg的劑量陰道內給藥〔11〕，氧氟沙星栓劑組以0.02 g/kg的劑量陰道內給藥〔9〕，模型組和假手術組大鼠陰道內置入等體積的賦形劑，持續7 d。

1.4.2大鼠陰道分泌物細菌轉陰率檢測 末次給藥24 h后，各組大鼠以無菌棉棒分別取陰道分泌物，涂抹在血瓊脂培養基上(無菌操作)，放置在37℃培養箱中培養，24 h后肉眼觀察是否出現菌落，連續兩次檢測均無細胞菌落出現，表示轉陰。轉陰率計算公式如下：轉陰率=出現細菌移位的大鼠數/各組大鼠總數(12)×100%。

1.4.3標本采集及HE染色 末次給藥24 h后，各組大鼠分別自尾靜脈每只采血1.5 ml，3 000 r/min，4℃下離心15 min后吸出上清液(血清)，置于Ep管中，保存在-80℃的冰箱中。以乙醚麻醉各組大鼠，隨后處死，分離并取下陰道黏膜組織，每只大鼠各取約1 g黏膜組織，保存于液氮中，剩余組織采用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，以濾紙吸干，置于10%甲醛溶液固定24 h，使用80%、90%、95%、100%的乙醇溶液依次脫水1.5 h，用透明劑二甲苯孵育2 h透明后，采用石蠟包埋組織塊，最后放入切片機中切片，選出完整、厚薄均勻的切片，使用二甲苯去除其中的石蠟，依次放入100%、95%、90%、80%的乙醇溶液中處理后轉移到蒸餾水中浸泡漂洗，按照試劑盒說明書的指導步驟做HE染色，然后將切片按上述操作方法再次脫水、透明后封片。

1.4.4大鼠陰道黏膜組織損傷情況檢測1.4.2中的陰道黏膜組織HE染色后的切片鏡下觀察并拍照，根據陰道黏膜組織平整度、下層、肌層等充血、水腫、炎性細胞浸潤等病理改變情況，對其炎癥程度進行評分，鏡下見：陰道黏膜平滑，無充血腫脹癥狀評為0分；鏡下見：陰道黏膜尚平滑，有輕度充血腫脹癥狀評為1分；鏡下見：陰道黏膜尚平滑，有中度充血腫脹癥狀，并出現點狀出血點評為2分；鏡下見：陰道黏膜不平滑，有重度充血腫脹癥狀，出現大量出血點評為3分。

1.4.5大鼠血清TNF-α、IL-6水平檢測 取出1.4.3中保存的血清在4℃下解凍，按照ELISA試劑盒說明書步驟測定血清TNF-α和IL-6水平。

1.4.6大鼠陰道黏膜組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平檢測 取0.5 g1.4.3中凍存的陰道黏膜組織在研缽中研碎，按照說明書的指導步驟做以RNAiso Plus提取其中總RNA，然后將其按照逆轉錄試劑盒說明書的指導步驟逆轉錄為cDNA，采用qRT-PCR檢測各組大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 mRNA水平，按照熒光定量試劑盒說明書的指導配制反應體系，并設定反應條件，內參基因選擇GADPH，通過2-ΔΔCt算法對所得數據進行分析。qRT-PCR引物序列：SDF-1：正義鏈：5'-GCATTGACCCGAAGCTAAAG-3'，反義鏈:5'-ACACACACACCTGGTCCTCA-3'，CXCR4：正義鏈：5'-GAGAAGCATGACGGACGGACAAGTA-3'，反義鏈：5'-GCAAAGATGAAGTCGGGAATAG-5'，GADPH：正義鏈：5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3';反義鏈：TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG。

1.4.7大鼠陰道黏膜組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平檢測1.4.3中剩余的約0.5 g凍存組織，加入含有一定濃度蛋白酶抑制劑的裂解液，冰水浴中勻漿，將勻漿液放入4℃離心機中，于3 000 r/min下離心20 min，按照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說明書的指導步驟測定上清液中蛋白總濃度并根據測定結果調整蛋白樣本為相同濃度，配制適宜濃度的十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)濃縮膠、分離膠，蛋白樣本變性煮沸后，進行電泳使蛋白分離，接著濕轉，使蛋白轉移至硝酸纖維膜，以5%的脫脂奶粉室溫孵育硝酸纖維膜2 h，封閉膜上蛋白，根據分子量剪下目的蛋白條帶，分別使用兔源anti-GAPDH一抗、兔源anti-CXCR4一抗、兔源anti-SDF-1一抗4℃孵育蛋白條帶過夜，TBST溶液洗膜后使用羊抗兔二抗室溫孵育2 h，TBST再次洗膜后，采用ECL法顯色，在凝膠成像儀中觀察蛋白表達并采集圖像，以Image-Pro plus 軟件分析圖像灰度值。

1.5統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行χ2檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1苦參凝膠對陰道黏膜組織病理形態的影響 與假手術組〔炎癥評分〔(0.36±0.04)分〕相比，模型組陰道黏膜組織水腫、炎癥細胞浸潤、出血破潰，黏膜不平滑，炎癥評分〔(2.83±0.11)分〕顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，藥物處理組〔苦參凝膠低、中、高劑量組炎癥評分為(2.08±0.09)分、(1.72±0.08)分、(0.55±0.05)分；氧氟沙星栓劑炎癥評分為(0.54±0.03)分〕，陰道黏膜組織上述病理癥狀減輕，炎癥評分均顯著降低，且苦參凝膠各組之間呈劑量依賴性作用，差異有統計學意義(P<0.05)；苦參凝膠高劑量組和氧氟沙星栓劑組相比，大鼠陰道黏膜組織上述病理癥狀減輕程度相似，炎癥評分差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組陰道黏膜組織病理形態(HE，×200)

2.2苦參凝膠對陰道中細菌轉陰率的影響 模型組大鼠陰道中細菌轉陰率為0；與模型組相比，藥物處理組大鼠陰道中細菌轉陰率顯著升高，且苦參凝膠各組之間呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)；苦參凝膠高劑量組和氧氟沙星栓劑組相比，大鼠陰道中細菌轉陰率差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 苦參凝膠對大鼠陰道中細菌轉陰率的影響〔n(%),n=12〕

2.3苦參凝膠對大鼠血清IL-6和TNF-α水平的影響 與假手術組相比，模型組大鼠血清IL-6和TNF-α水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，藥物處理組大鼠血清IL-6和TNF-α水平降低，且苦參凝膠各組之間呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)；苦參凝膠高劑量組和氧氟沙星栓劑組相比，大鼠血清IL-6和TNF-α水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平比較

2.4苦參凝膠對大鼠陰道黏膜組織SDF-1和CXCR4 mRNA水平的影響 與假手術組相比，模型組大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 mRNA水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，藥物處理組大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 mRNA水平降低，且苦參凝膠各組之間呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)；苦參凝膠高劑量組和氧氟沙星栓劑組相比，大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 mRNA水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠陰道黏膜組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平比較

2.5苦參凝膠對大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 蛋白水平的影響 與假手術組相比，模型組大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，藥物處理組大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 蛋白表達降低，且苦參凝膠各組之間呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)；苦參凝膠高劑量組和氧氟沙星栓劑組相比，大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表4。

1～6：假手術組；模型組；苦參凝膠低劑量組；苦參凝膠中劑量組；苦參凝膠高劑量組；氧氟沙星栓劑組圖2 Western印跡檢測各組陰道黏膜組織SDF-1、CXCR4 蛋白表達

表4 各組大鼠黏膜組織中SDF-1、CXCR4 蛋白水平比較

3 討 論

陰道炎是婦科最常見的下生殖道感染性疾病，女性患病率約為18%，是各種陰道黏膜炎性疾病的總稱，其中細菌性陰道炎約占40%，近年來我國婦女發病率呈增長趨勢，嚴重影響女性的生殖健康〔13，14〕。細菌性陰道炎大多是感染葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等多種細菌引起，在中醫上屬于陰癢、帶下病范疇，由脾虛生濕，濕熱下注，邪毒內侵，外陰不潔、濕蘊生蟲等所致，以清熱解毒，除濕止癢為治療原則〔15〕，苦參作為我國傳統中藥，性寒味苦，具有清熱解毒、祛風殺蟲、燥濕利尿等多種功效，在臨床上可用來治療多種婦科炎癥〔16〕，苦參凝膠是一種藥物賦形劑，有效成分為苦參總堿，研究表明，可用來治療細菌性陰道炎，和甲硝唑片聯合應用可降低其陽性率及復發率，提高臨床治療效果〔17〕。本研究結果表明葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌可引起細菌性陰道炎，使大鼠發生炎癥反應，導致陰道黏膜出現充血、水腫、炎性細胞浸潤等癥狀，陰道內給藥治療可殺滅細菌，減輕炎癥反應，修復陰道黏膜功能，進一步證明了其對細菌性陰道炎的治療作用。

SDF-1對炎性細胞活化和遷移起到重要的調節作用，進而介導機體炎癥反應，研究發現在心肌梗死病理過程中SDF-1/CXCR4 軸被激活，其對心肌梗死的病情發展具有重要的調節作用〔18〕。另外SDF-1/CXCR4在類風濕關節炎患者外周血中高表達，可調節病情的進展〔19〕，而苦參可調節SDF-1/CXCR4 軸的激活，薛天陽等〔20〕發現苦參堿可抑制體外培養人腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞CXCR4 mRNA表達，進而誘導細胞凋亡，因此可推測下調SDF-1/CXCR4 軸，可能是苦參凝膠治療細菌性陰道炎的藥理機制之一。本研究表明苦參凝膠可下調細菌性陰道炎大鼠陰道黏膜組織中SDF-1及CXCR4表達，揭示苦參凝膠治療細菌性陰道炎的藥理機制之一可能是下調SDF-1/CXCR4通路。

綜上所述，苦參凝膠能殺滅致病菌，降低大鼠炎癥反應，修復陰道黏膜功能，對治療細菌性陰道炎具有較好的療效，下調SDF-1及CXCR4信號通路可能是其作用機制之一。本研究證實了苦參凝膠對細菌性陰道炎的治療作用，并對SDF-1/CXCR4 軸在其中的作用進行了初步探索，但更確切的分子機制未涉及，還需要進一步研究。