左卡尼汀對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化的保護作用

馬玉杰 樸尚國 李慧瑛 姜玉姬 玄美英 鄭海蘭 金吉哲 金英順 李燦

(延邊大學附屬醫院 1腎病科，吉林 延吉 133000； 2體檢科)

根據美國腎臟數據服務年度報告，慢性腎臟病(CKD)在普通人群中的總體患病率已超過14%，并且每年呈上升趨勢〔1〕。CKD進展為終末期腎病(ESRD)需要昂貴的腎臟替代治療，因此，減緩這種臨床癥候群不僅可以提高CKD患者的生活質量，而且可減輕社會經濟負擔。腎小管間質纖維化(TIF)是CKD的最終病理學特征。單側輸尿管梗阻(UUO)是TIF的代表性動物模型，其表現為腎間質炎癥反應、腎小管擴張和萎縮及 TIF 的形成，其分子機制極其復雜，包括炎性介質、致纖因子、氧化應激、程序性細胞死亡等因素的參與〔2,3〕。

左卡尼汀(LC)又稱左旋肉毒堿，是一種季銨化合物，其主要功能是促進脂類代謝。作為脂肪酸β-氧化的輔助因子，既能將長鏈脂肪酸帶進線粒體基質，促進其氧化分解，為細胞提供能量，又能將線粒體內產生的短鏈脂?；敵?。另外，LC 有助于維持線粒體內脂肪酸β-氧化,抑制自由基的生成，并通過氧化膜脂的更新保護組織免受損傷〔4〕。因此，LC具有非脂類代謝依賴的抗氧化作用。研究表明，LC對腎缺血再灌注〔5〕、造影劑腎病〔6〕、高血壓相關性腎纖維化〔7〕、順鉑腎病〔8〕和腎病綜合征〔9〕具有保護作用。類似的保護作用亦可在糖尿病足細胞損傷〔10〕和心肌梗死〔11〕中觀察到。本實驗探討LC對UUO所致大鼠TIF的保護作用。

1 材料和方法

1.1建立動物模型與藥物治療 38只雄性SD大鼠購自延邊大學動物實驗室，體重220～240 g。經1 w的適應期后，大鼠在相應的代謝籠中進行12 h的人工光暗循環，允許自由進食標準的飼料和飲用水。 體重匹配的大鼠隨機分為假手術組(n=6)、UUO7組(n=8)、 UUO7+LC組(n=8)、UUO14組(n=8)和UUO14+LC組(n=8)。在苯巴比妥40 mg/(kg·d)麻醉下，UUO組行側后腹切口游離左側輸尿管并結扎，假手術組僅游離輸尿管后縫合皮膚。UUO組給予腹腔注射LC 〔200 mg/(kg·d)，Sigma Aldrich C0158〕，而假手術組給予等量生理鹽水，分別于第7天、第14天處死大鼠。收集尿液和腎組織標本以備進一步檢測。該動物實驗獲得延邊大學附屬醫院動物倫理委員會批準。

1.2實驗用抗體 采用免疫組化和Western印跡的抗體如下：轉化生長因子(TGF)-β1(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)；結締組織生長因子(CTGF)(#ab125943)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2(#ab38929)、 單核巨噬細胞抗原(ED)-1 (Serotec Inc.,UK),骨橋蛋白(OPN,#ab8448,Abcam,UK)、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1 (Santa Cruz Biotechnoogy,Inc.)、Toll樣受體(TLR)-2 (Santa Cruz Biotechnoogy,Inc.)、超氧化物歧化酶(SOD)2(#ab13534,Abcam,Cam-bridge,MA),煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAPDH)氧化酶(NOX)-2 (#ab31092,Abcam,UK)、 線粒體外膜易位酶(TOMM)20 (#ab186734,Abcam,UK),NADH脫氫酶(輔酶Q)1a復合體亞基(NDUFA)10 (#ab96464,Abcam,UK),琥珀酸脫氫酶黃素蛋白(SDHA，#ab66484,Abcam,UK),線粒體動力樣蛋白(DLP1/Drp1，BD Transduction Laboratories,Lexington,KY),視神經萎縮蛋白(OPA)1 (#ab90857,Abcam,UK)、β-actin (#ab8226,Abcam,UK)。

1.3尿8-羥脫氧鳥苷(8-OHdG)水平測定 根據試劑盒操作步驟用酶聯競爭免疫吸附法測定尿 8-OHdG DNA加合物水平(Cell Biolabs，San Diego，CA，USA)。

1.4腎臟病理 獲取的腎組織由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液(PLP)固定，石蠟包埋后切片，行trichrome和HE染色，采用彩色圖像自動分析儀(Polygon program，TDI Scope Eye Version 3.5 for Windows；Olympus，Japan)高倍鏡視野下分析TIF程度。每個標本至少觀察20個非重疊區域取平均數。

1.5免疫組織化學染色 免疫組化步驟簡述如下：石蠟包埋切片置二甲苯脫蠟，梯度酒精中脫水，37℃ 下 0.3% 過氧化氫/甲醛 30 min處理后，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗3次。置微波爐中加熱行微波爐抗原修復(98℃ 5 min)。室溫下非免疫性血清封閉液20 min。在4℃下滴加抗ED-1 單克隆抗體和抗OPN孵育12～16 h。PBS洗3次后滴加Ⅱ抗,溫孵育2 h。以二氨基聯苯胺(DAB)為底物顯色，呈棕黃色為止。自來水流水洗滌，復染蘇木素，常規樹脂封片。染色程度用數字化顯微鏡分析儀(TDI Scope EyeTMVersion 3.0 for Windows，Olympus，日本)，Polygon 程序算出每0.5 mm2染色面積的百分比。

1.6電鏡觀察 腎皮質組織在二甲胂酸鈉溶液配制的戊二醛固定48 h，磷酸緩沖液沖洗3次，1%鋨酸固定2 h，雙蒸水沖洗，常規脫水、環氧樹脂定向包埋，LKB-V型超薄切片機先行半薄切片，甲苯胺藍染色，光鏡定位后行超薄切片，厚50～70 nm，醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色，1200EX(JEOL)型透射電鏡觀察。

1.7Western印跡 腎組織用蛋白裂解液制成勻漿，室溫下離心后取上清液測定蛋白濃度，20 μg標本在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉膜2 h后，4℃下置Ⅰ抗于非脂牛乳中以1∶1 000濃度孵育12～16 h，緩沖液洗3次后加辣根過氧化物酶標記的驢抗兔IgG(Amersham)1 h緩沖液洗3次，增強發光(ECLTM，Amersham)和曝光。以對照組為標準(100%)測定條帶的光密度，以β-actin為內參。

1.8統計學處理 采用 SPSS21.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Bonferroni post hoc校正。

2 結 果

2.1LC對UUO所致TIF的作用 肉眼可見UUO導致腎臟體積增大、腎盂擴張積水、皮質變薄，這種改變在UUO第14 天尤為明顯。Trichrome染色、HE染色提示主要病變位于腎小管間質，表現為小管基底膜增厚、腎小管壞死、空泡形成、炎性細胞浸潤、腎小管萎縮、間質纖維化(圖1)；電鏡檢查清楚可見萎縮的、空泡變性的小管和束狀膠原纖維在腎間質沉積(圖2)。定量計分系統分析表明LC明顯減少TIF程度呈時間依賴性。Western印跡結果顯示LC抑制UUO所致的TGF-β1、CTGF、MMP-2的高表達。見表1。

A：UUO肉眼觀察;B：Trichrome 染色(×200)；C：HE染色(×200)圖1 各組腎臟肉眼觀察和病理組織變化

圖2 電鏡觀察各組腎小管損傷特征及Western印跡法分析致纖因子蛋白的表達

表1 各組TIF半定量分析及TGF-β1、CTGF、MMP2 Western印跡表達量

2.2LC對UUO所致炎性反應的作用 免疫組化結果表明UUO導致大量的ED-1陽性細胞在腎小管間質浸潤和炎性介質OPN高表達(表2和圖3)。LC治療分別在UUO第7、14天顯著減少ED-1陽性細胞數和OPN的免疫活性。另外，Western印跡結果顯示LC明顯下調MCP-1、TLR-2的表達且呈時間依賴性 (表2和圖4)。以上結果表明LC治療對UUO所致的腎損傷具有抗炎作用。

表2 各組免疫組化陽性細胞半定量分析及MCP-1、TLR-2 Western印跡表達量

圖3 各組ED-1和OPN免疫組化(×200)

圖4 電鏡觀察UUO7組及UUO7+LC組中炎性細胞浸潤

2.3LC對UUO所致氧化應激的作用 8-OHdG在大鼠尿中的含量隨UUO時間遞增，LC治療明顯減少尿8-OHdG的含量。 Western印跡結果表明LC通過增加 SOD2的表達和減少NOX-2的表達，保持氧化酶和抗氧化酶的平衡(圖5，表3)。

1～5：假手術組,UUO7組,UUO7+LC組,UUO14組,UUO14+LC組，圖7同圖5 各組氧化應激相關指標變化

表3 各組24 h尿中8-OHdG排泄量及SOD2、NOX-2 Western印跡表達量

2.4LC對UUO所致染色體失功的作用 透射電鏡表明，UUO所致線粒體結構損傷表現為線粒體嵴腫脹、碎片(分裂)、 融合，造成線粒體體積變少和數量減少(圖6)。通過定量分析系統，LC保持了線粒體結構的數量和大小的完整性。Western印跡分析表明，與假手術組相比，UUO組 TOMM20、 NDUFA10、SDHA、OPA1的表達明顯受到抑制，反之，Drp1表達增加，LC治療逆轉了上述指標(圖7，表4)。

A：正常線粒體(×20 000)；B：UUO組腎組織線粒體數量減少(×20 000)；C： UUO組線粒體空泡變性(箭頭，×20 000)；D：UUO組自噬體形成(箭頭，×20 000)；E：UUO組線粒體分為兩個子細胞器(分裂，箭頭，×30 000)；F：UUO組線粒體融合(圓形，×40 000)圖6 電鏡觀察各組腎組織線粒體形態典型特征

OPA1 L：長鏈OPA1；OPA1 S：短鏈OPA1圖7 Western印跡分析線粒體功能相關蛋白的表達

表4 各組線粒體大小和數量半定量分析及線粒體功能相關因子Western印跡表達量

3 討 論

大量研究表明，炎癥在腎損傷中起著關鍵作用，因為它先于腎纖維化形成。炎癥反應是對損傷性刺激的一種保護性本能反應。然而持續的炎癥可刺激腎小管上皮細胞、肌成纖維細胞、巨噬細胞等分泌炎性介質和致纖因子，導致細胞外基質蛋白在腎小管間質沉積，形成不可逆的腎纖維化。其中，巨噬細胞是纖維化相關趨化因子和細胞因子如MCP-1、趨化因子受體、黏附分子和TGF-β1的主要來源〔12〕。而趨化因子和 TGF-β1反過來招募炎癥細胞聚集，形成惡性循環。本研究發現LC減少了腎小管間質ED-1陽性細胞數，同時抑制了炎癥介質OPN、MCP-1和TLR-2及TGF-β1和CTGF的高表達，降低了UUO所致MMP-2蛋白表達，從而改善了TIF程度。因此，LC在UUO大鼠模型中具有抗炎和抗纖維化作用。

LC對UUO大鼠模型發揮抗炎和抗纖維化作用的過程可能有多因素參與共同完成，其中氧化應激是決定性因素。UUO引起的缺血缺氧而引發氧化應激損傷，最終導致腎臟炎癥和纖維化形成。Kim等〔13〕報道甲硫氨酸硫氧化物還原酶A缺乏可通過增加膠原沉積而加重UUO誘導的腎纖維化進展，而這種腎纖維化在可溶性環氧化物水解酶基因敲除小鼠中或通過使用抗氧化劑維生素E可以得到緩解，進一步確認了氧化應激在UUO所致腎纖維化中的作用。LC直接抑制還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶誘導的大鼠腎上皮細胞(NRK-52E)和HK-2細胞內活性氧的生成。Xiang等〔14〕報道LC降低腎內8-OHdG的表達，從而防治環孢素A誘導的腎損傷。 本實驗觀察到LC不僅增加了UUO組抗氧化酶蛋白的表達，而且減少了氧化酶蛋白的表達及尿8-OHdG水平，促使抗氧化酶蛋白和氧化酶蛋白平衡，以達到氧化應激最小化。這與之前在肝臟、心臟、大腦和糖尿病中的報道〔15～18〕一致，表明LC具有強大的抗氧化能力。

LC還可以通過保護線粒體網絡的完整性來減輕腎臟炎癥和纖維化。線粒體是一種存在于大多數細胞中的由兩層膜包被的細胞器，是細胞制造能量的主要結構，更是細胞進行有氧呼吸的主要場所，在維持細胞能量穩態中起關鍵作用，同時也是活性氧的主要來源。在病理條件下，線粒體功能障礙可導致炎癥、氧化應激損傷和隨之而來的細胞程序性死亡。因此，氧化應激和線粒體異常是相互作用相互關聯的。研究表明〔17〕，LC可改善老年大鼠腦線粒體生物合成和線粒體動力學，并保護高熱量飲食加鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病小鼠線粒體功能。本研究結果表明，UUO 7 d破壞了線粒體的正常結構，造成線粒體功能紊亂，尤其是在UUO 14 d。LC治療明顯維護了線粒體體積、保存了線粒體的絕對數量。Western印跡結果提示，LC調節了線粒體相關基因蛋白的表達。綜上，LC發揮抗炎、抗纖維化作用與減少氧化應激、保護線粒體網絡完整性密切相關。

在臨床實踐中，使用LC通常用于治療由遺傳疾病、慢性血液透析或慢性心力衰竭引起的肉堿缺乏癥。 由于LC具有抗氧化活性，它可能廣泛地應用于多種疾病。如使用LC可以改善血液透析患者的心血管損傷及心絞痛、左心室擴大或擴張和心律失常的心肌梗死。此外，對脂肪肝和非酒精性肝病也有良好的改善作用。LC對UUO所致腎間質纖維化具有抗炎、抗纖維化作用，抑制氧化應激和保護線粒體是其發揮腎臟保護作用的分子機制。