靶向抑制LncRNA-ATB對子宮內膜癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的影響

呂靜 劉超 李可佳 周曉慧 薛晶 王明娟

(承德醫學院 1基礎醫學院,河北 承德 067000;2附屬醫院心臟內科;3形態學實驗中心)

子宮內膜癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，近年來發病率呈上升趨勢，且晚期、復發性子宮內膜癌預后極差，臨床治療十分困難〔1，2〕。因此尋找特異性強的分子標志物及子宮內膜癌致病機制的確切靶點用于子宮內膜癌的早期診斷和治療尤為重要。長鏈非編碼RNAs(LncRNAs)是一類不具有編碼蛋白質功能，核苷酸長度>200 nt的RNA分子，在多種腫瘤的發生發展中發揮至關重要的作用，是潛在的腫瘤標志物及治療靶點〔1，3，4〕。LncRNA-ATB位于人類第13、14、22號染色體上，研究發現在多種腫瘤中異常表達，如肝細胞癌〔5〕、肺小細胞癌〔6〕、結腸癌〔7〕、乳腺癌〔8〕等。但其對子宮內膜癌細胞生物學行為的影響尚未見報道。本研究通過靶向抑制子宮內膜癌細胞內LncRNA-ATB的表達，觀察LncRNA-ATB對子宮內膜癌細胞增殖能力、凋亡水平、遷移和侵襲能力的影響，以期為尋找早期診斷子宮內膜癌的分子標志物及其治療的確切靶點提供有價值的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 人子宮內膜癌Ishikawa細胞株購自南京凱基生物公司，人子宮內膜癌HEC-1-A細胞株購自北京北納聯創公司，RPMI1640培養基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，McCoy 5A培養基購自中科邁晨，TRIzol試劑、Lipofectamine2000、熒光定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司，二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶-二氨基聯苯胺(EDTA)消化液(0.25%)、胰蛋白酶(0.25%，不含EDTA和酚紅)，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Solarbio公司，FITC標記的Annexin-V及碘化丙啶(PI)試劑購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司，LncRNA-ATB-SiRNA及LncRNA-ATB-NC由上海吉瑪公司設計并合成，RNA逆轉錄和實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2實驗分組 LncRNA-ATB干擾組(ISK-siRNA組和HEC-siRNA組)：轉染LncRNA-ATBsiRNA；陰性對照組(ISK-NC組和HEC-NC組)：轉染LncRNA-ATB-NC；空白對照組(ISK組和HEC組)：僅以10%FBS培養基培養細胞。

1.3轉染 將Ishikawa細胞、HEC-1-A細胞分別常規培養于含10%FBS的培養基中，取對數生長期的細胞進行實驗。將細胞密度調整為5×105/ml，將Ishikawa細胞、HEC-1-A細胞分別接種于6孔板，接種24 h后，細胞密度達到60%～70%，按照實驗分組進行轉染，轉染試劑的配制參照Lipofectamie2000說明書。轉染5 h后更換為含10%FBS的完全培養基繼續培養。

1.4qRT-PCR檢測細胞中LncRNA-ATB mRNA的表達水平 轉染24 h后，TRIzol法分別提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA作為模板。LncRNA-ATB引物上游序列：5′-TCCTGGCTGTGGACTGGCTA-3′，下游序列：5′-TGTATCAACTCAGGCTCTGTGCTTC-3′，擴增產物長度：133 bp。內參GAPDH引物上游序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴增產物長度：138 bp。反應條件：預變性95℃、15 min，變性95℃、10 s，退火60℃、30 s，40個循環，重復3次。用2-△△Ct方法計算目的基因表達量。

1.5MTT法檢測細胞增殖能力 取對數生長期細胞，調整細胞密度為5×105/ml，接種于96孔板，24 h后進行轉染，每組設置3個復孔，并設置調零孔，邊緣孔加入PBS。分別于轉染后24、48、72 h每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育4 h，終止培養，吸除孔內培養液，每孔加入150 μl DMSO，震蕩溶解，酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。

1.6Annexin V-FITC/PI細胞凋亡率檢測 收集轉染后48 h各組細胞，PBS清洗2遍，胰酶消化(無EDTA)，1 000 r/min離心5 min，棄培養液，加入2 ml PBS輕輕吹打，混勻，過篩網入另一組流式管，1 000 r/min離心5 min，棄PBS，加入100 μl緩沖液、5 μl FITC、5 μl PI輕混，室溫避光反應15 min，再加入400 μl緩沖液，進行流式細胞儀檢測。

1.7Transwell小室檢測遷移能力 收集轉染24 h的各組細胞，PBS沖洗2遍，胰酶消化，培養液終止消化，離心，棄培養液，PBS清洗2遍，基培重懸，調整細胞密度為5×105/ml。每孔上室加入200 μl單細胞懸液，下室加入600 μl含20%FBS培養液。將小室放入37℃、5%CO2培養箱中孵育24 h。取出小室，PBS沖洗2遍，4℃預冷的甲醛固定30 min，風干，0.1%結晶紫染色15 min，棉簽擦去上層未遷移細胞，倒置顯微鏡下隨機觀察5個視野細胞數量計數，取平均值，實驗重復3次。

1.8Transwell小室檢測侵襲能力 將預置膠的Transwell小室從-20℃冰箱中取出，于上室和下室中分別加入500 μl基培，置于37℃、5%CO2培養箱中水化2 h。加入細胞懸液后在37℃、5%CO2培養箱中孵育30 h，其余實驗方法同遷移實驗。

1.9統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1qRT-PCR檢測轉染24 h后各組細胞中LncRNA-ATB mRNA的表達水平 Ishikawa中ISK-siRNA組LncRNA-ATB mRNA相對表達水平(0.167±0.050)顯著低于ISK-NC組(0.923±0.066)和ISK組(1.000±0.000，P<0.05)，ISK-NC組和ISK組比較差異無統計學意義(P>0.05)；HEC-1-A細胞中HEC-siRNA組LncRNA-ATB mRNA相對表達水平(0.035±0.012)低于HEC-NC組和HEC組(0.968±0.056，1.000±0.000)，差異有統計學意義(P<0.05)，HEC-NC組和HEC組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2MTT檢測轉染24、48、72 h后各組細胞增殖活性比較 ISK-siRNA組48、72 h OD值顯著低于ISK-NC組(P<0.05)，見圖1； HEC-siRNA組24、48 h OD值顯著低于HEC-NC組(P<0.05)，見圖2。

與ISK-NC組比較：1)P<0.05圖1 LncRNA-ATB對Ishikawa細胞增殖的影響

與HEC-siRNA組比較：1)P<0.05圖2 LncRNA-ATB對HEC-1-A細胞增殖的影響

2.3各組細胞凋亡率比較 ISK-siRNA組細胞總凋亡率為(21.990±1.265)%，ISK-NC組為(6.870±1.128)%，差異有統計學意義(P<0.05)。HEC-siRNA組細胞總凋亡率為(18.027±1.585)%，HEC-NC組為(9.090±1.896)%，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3，圖4。

圖3 LncRNA-ATB對Ishikawa細胞凋亡的影響

圖4 LncRNA-ATB對HEC-1-A細胞凋亡的影響

2.4各組細胞遷移能力比較 遷移實驗結果顯示，ISK-siRNA組細胞穿膜細胞數〔(19.1±3.0)個〕少于ISK-NC組〔(34.4±2.4)個〕，差異有統計學意義(P<0.05)；HEC-siRNA組細胞穿膜細胞數〔(22.8±2.2)個〕少于HEC-NC組〔(45.9±2.8)個〕，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5，圖6。

圖5 LncRNA-ATB對Ishikawa細胞遷移的影響(0.1%結晶紫染色，×200)

2.5各組細胞侵襲能力比較 侵襲實驗結果顯示，ISK-siRNA組細胞穿膜細胞數〔(15.8±2.2)個〕少于ISK-NC組〔(31.0±3.8)個〕，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖7；HEC-siRNA組細胞穿膜細胞數〔(20.5±2.3)個〕少于HEC-NC組〔(40.7±3.1)個〕，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖8。

圖8 LncRNA-ATB對HEC-1-A細胞侵襲的影響(0.1%結晶紫染色，×200)

3 討 論

近來研究表明，LncRNA在腫瘤的發生發展過程中發揮促癌或抑癌的作用，參與了細胞增殖、凋亡調控及腫瘤浸潤與轉移等〔9〕。LncRNA-ATB全長2 446 nt，位于人14號染色體上，相關研究表明，LncRNA-ATB在多種腫瘤細胞中異常表達，并調控腫瘤細胞的增殖、凋亡及遷移、侵襲等生物學特性〔10，11〕。Shi等〔8〕研究發現，下調LncRNA-ATB的表達可抑制曲妥珠單抗耐藥SKBR-3細胞的增殖并促進SKBR-3細胞的凋亡。趙偉等〔12〕通過LncRNA-ATB-shRNA有效沉默LncRNA-ATB在人淋巴瘤Ragi中的表達后，發現細胞增殖能力受抑制，凋亡能力提高，細胞周期停滯在G1期。本研究利用siRNA干擾載體沉默LncRNA-ATB構建了LncRNA-ATB低表達子宮內膜癌細胞Ishikawa、HEC-1-A細胞株，結果表明LncRNA-ATB可能作為癌基因，以相同的作用機制促進子宮內膜癌細胞增殖，抑制其凋亡。

上皮細胞間質化(EMT)是上皮細胞向間質細胞轉化的過程，是腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力的主要步驟〔13〕，當腫瘤細胞發生侵襲轉移時，EMT可誘導腫瘤細胞獲得耐凋亡、免疫豁免等干細胞特性，上皮細胞失去細胞間連接，細胞內細胞骨架重構，細胞的運動性增加，從而促進腫瘤的侵襲轉移。EMT時表現為維持細胞上皮性基因表達降低，如細胞黏附因子(E-cadherin)，而表現細胞間葉性質的基因上調，如波形蛋白(Vimentin)、鈣黏素(N-cadherin)〔14〕。研究證明miR-141-3P靶向抑制TM4SF1的表達進而抑制胰腺癌細胞的遷移與侵襲，乳腺癌細胞中miR-141-3P也有同樣的作用〔15〕。ZEB1可以減少基底膜的合成，同時激活基質金屬蛋白酶(MMP)1、MMP9、MMP14的表達，從而促進基底膜的重塑和細胞對周圍組織的侵襲〔16〕。體外實驗證明miR-200c高表達可以通過抑制靶基因ZEB1影響細胞EMT作用。LncRNA-ATB通過競爭性結合抑制miR-141-3P表達，促進EMT相關因子N-cadherin、Vimentin、ZEB1和ZEB2表達，并抑制EMT相關因子E-cadherin表達，促進EMT發生，增強乳腺癌的侵襲和轉移能力〔17〕。本研究結果推測LncRNA-ATB增強子宮內膜癌細胞轉移侵襲能力有可能是通過競爭性結合并抑制miR-141-3P/miRNA-200c的表達，促進腫瘤的EMT而實現。

綜上，LncRNA-ATB可以調控促進子宮內膜癌細胞增殖、抑制凋亡并增強其轉移侵襲能力，此研究結果將為子宮內膜癌轉移的臨床治療提供重要的理論和實驗依據，但其確切的分子機制還有待進一步研究。