加味柴芍六君顆粒對潰瘍性結腸炎模型大鼠腸黏膜屏障及MEK-ERK-MLCK通路的影響

陳龍開 萬星陽 羅緒 周泠 黃海舸

(1遵義醫科大學附屬醫院中醫科，貴州 遵義 563000；2中山大學附屬第六醫院中西醫結合肛腸科；3右江民族醫學院附屬醫院胃腸外科)

潰瘍性結腸炎(UC)是由結直腸的慢性非特異性炎癥反應引起的常見疑難病〔1〕。目前西醫尚無有效的治療方法，而中醫認為肝郁脾虛會引起潰瘍性結腸炎，加味柴芍六君顆粒具有疏肝解郁、理氣健脾之功效，預計可治療潰瘍性結腸炎〔2〕。肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)，是一種鈣調素(CaM)依賴酶，可以介導構成腸黏膜上皮細胞機械屏障的關鍵結構即緊密連接(TJ)的通透性動態調節過程，進而調控腸黏膜通透性，腸黏膜通透性增加是UC的主要病理改變〔3～5〕。MLCK主要由絲裂原活化蛋白激酶激酶-細胞外調節蛋白激酶(MEK-ERK)信號激活，MEK激活ERK并使之磷酸化，p-ERK轉移到核內與 MLCK結合，進而磷酸化并激活MLCK，最終影響腸黏膜屏障的通透性〔6〕。目前加味柴芍六君顆粒是否能治療UC及其分子機制還不清楚，本研究通過觀察加味柴芍六君顆粒對大鼠腸黏膜屏障及MEK-ERK-MLCK通路的影響，以探討加味柴芍六君顆粒對UC的療效及其可能藥理機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF清潔級SD雄性大鼠60只，體重為180～220 g，由遵義醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證：SCXK(貴)2017-0013，動物合格證號：0000623，飼養條件為：溫度為25℃，濕度為50%，噪音低于85 dB，每小時通風換氣8～12次。

1.2實驗藥品、試劑及儀器 加味柴芍六君顆粒(主要藥物成分：柴胡10 g，白芍 15 g，陳皮 6 g，制半夏 10 g，太子參 15 g，茯苓 15 g，炒白術 15 g，甘草 6 g，白花蛇舌草 20 g，三七10 g，風尾草 20 g)購自江蘇省江陰市天江藥業有限公司；TNBS(批號89168-064)購自Amresco 公司；髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒(批號YM-SX1873)購自上海遠慕生物科技有限公司；RNAiso Plus(批號9108)、逆轉錄試劑盒(批號RR037Q/A/B)、熒光定量PCR試劑盒(批號639519)購自日本Takara公司；MEK、ERK、MLCK、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；兔源GAPDH抗體(批號ab181602)、MEK抗體(批號ab96379)、ERK抗體(批號ab32537)、p-ERK抗體(批號ab192591)、MLCK抗體(批號ab232949)、p-MLCK(批號ab200809)，羊抗兔二抗(批號ab150077)，購自Abcam公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(批號C0105)、蛋白提取試劑盒(批號P0027)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(批號P0011)、EP管、移液槍槍頭購自上海碧云天生物技術有限公司。Elx800酶標儀購自美國Bio-Rad公司；制冰機、恒溫水浴鍋購自北京六一儀器廠；光學顯微鏡購自日本尼康公司；熒光定量PCR儀、臺式高通量DNA合成儀購自Thermo公司；垂直電泳儀及轉移系統、射線攝影暗厘，均購自廣州藝佳生物。

1.3方法

1.3.1動物模型制備及給藥方法 60只SD雄性大鼠隨機分為對照組，模型組，加味柴芍六君顆粒低(0.25 g/ml)、中(0.50 g/ml)、高劑量(1.00 g/ml)組，根據文獻用藥量換算到大鼠將加味柴芍六君顆粒配制成濃度為0.25 g/ml、0.50 g/ml、1.00 g/ml的溶液〔7〕。根據文獻按以下方法造模：除對照組正常照常飲食，其余各組禁食24 h后腹腔麻醉，將一直徑2.0 mm、長約12 cm的塑膠管由肛門輕緩插入大鼠體內深約8 cm，緩慢注入TNBS乙醇溶液，劑量為100 mg/kg，給藥完畢，緩慢拔出塑膠管，提起大鼠尾部，持續倒置5 min，使造模劑充分滲入大鼠腸腔內，待其自然蘇醒，常規飼養〔8〕。大鼠出現腹瀉、黏液膿血便后，造模成功，然后加味柴芍六君顆粒低、中、高劑量治療組每天單位體重給以相同體積的劑量(10 ml/kg)灌胃治療，連續5 w，模型組和對照組以等劑量的生理鹽水灌胃，持續5 w。

1.3.2大鼠疾病活動指數(DAI)評分及標本采集 藥物治療后，觀察各組大鼠體重變化、大便性狀、便血情況進行DAI評分，評分標準如表1〔9〕。

表1 DAI評分標準

各組大鼠末次給藥后，禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液全麻后處死，解剖分離大鼠結腸組織，以0.9%的氯化鈉溶液沖洗結腸內外，潔凈后濾紙吸干多余溶液-80℃凍存或者將結腸剪切為約1 cm的長度，4% 多聚甲醛中固定后，分別浸入低濃度到高濃度酒精中脫去組織中的水分，再浸入透明劑二甲苯中透明，然后石蠟包埋，進行常規病理切片做HE染色。

1.3.3HE染色實驗1.3.2中的切片用二甲苯脫去石蠟，再經由高濃度到低濃度酒精，最后浸入蒸餾水后進行染色。步驟是：①以蘇木素水溶液中染色5 min。②在酸水及氨水中分色，30～40 s。③流動蒸餾水沖洗1 h后浸泡片刻。④浸入70%和90%酒精中各脫水10 min。⑤以酒精伊紅染色液染色約2 min。最終切片經純酒精脫水、二甲苯透明，蓋上蓋玻片封固后在光學顯微鏡下觀察。

1.3.4大鼠結腸組織學評分(HI)1.3.2中的結腸組織清洗干凈后肉眼觀察結合HE染色的切片鏡下觀察結果，根據結腸黏膜的充血、水腫、潰瘍和糜爛等病理改變情況，進行HI評分，評分標準〔10〕：無損傷0分，黏膜充血、水腫、未出現潰瘍1分，黏膜充血、水腫、輕度糜爛，無潰瘍2分，黏膜充血、水腫、中度糜爛，有單個潰瘍3分，黏膜充血、水腫、高度糜爛，有多處潰瘍4分，黏膜充血、水腫、重度糜爛，潰瘍>1 cm 5分。

1.3.5大鼠結腸組織MPO檢測1.3.2中的凍存組織剪碎，用MPO檢測試劑盒中的試劑制備組織勻漿，并嚴格按試劑盒的檢測步驟進行檢測。

1.3.6RT-PCR法檢測結腸組織中MEK、ERK、MLCK mRNA表達1.3.2中的凍存組織剪碎，參照RNAiso Plus的說明書的步驟提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒的操作步驟將其逆轉錄為cDNA，RT-PCR引物序列：MEK正義鏈：AGTCTCGGAGGATGTTGG、反義鏈：TTGAAGGCTTACGGTGCT，133 bp；ERK正義鏈：CTAAACCACATCGGGAACCT、反義鏈：TACTTCCGGGCTTTGATGGA，188 bp；MLCK正義鏈：CCTGAGGAGAACAAGGAGCA、反義鏈：TTCTGGCTCTCTTCCCACAG，113 bp；GADPH正義鏈：TGTGTCCGTCGTGGATCTGA、反義鏈：TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG，130 bp。反應體系為20 μl：2×SYBR Mix10 μl，RNase Free dH2O 8 μl,上下游引物各0.5 μl,10×cDNA模板1 μl。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性10 s、60℃退火30 s，72℃延伸60 s，40個循環。以GADPH為內參基因，根據2-ΔΔCt算法對各組mRNA表達量進行分析。

1.3.7Western印跡檢測結腸組織中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白的表達1.3.2中的凍存組織剪碎，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，按照BCA試劑盒的說明測定蛋白濃度，根據測定結果調整所有蛋白樣本為相同濃度，然后將蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離，濕轉全部轉移至硝酸纖維膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，截取MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK、GAPDH蛋白條帶，分別加入相應的抗體4℃孵育過夜，TBST溶液洗膜后室溫孵育對應的二抗2 h，TBST清洗后ECL顯色曝光得到蛋白條帶，觀察并分析蛋白的相對表達量。

1.4統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1加味柴芍六君顆粒對HI評分的影響 與對照組相比，模型組大鼠結腸組織黏膜充血、水腫、糜爛，出現潰瘍，HI明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，加味柴芍六君顆粒低、中、高劑量組大鼠結腸組織黏膜充血、水腫、糜爛等病理癥狀均好轉，HI評分明顯下降且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1、2，表2。

A：對照組；B：模型組；C：加味柴芍六君顆粒低劑量組；D：加味柴芍六君顆粒中劑量組；E：加味柴芍六君顆粒高劑量組，下圖同圖1 肉眼觀察各組大鼠結腸組織的形態

圖2 鏡下觀察各組大鼠結腸組織HE染色的結果(×100)

表2 加味柴芍六君顆粒對DAI評分的影響分，n=12)

2.2加味柴芍六君顆粒對DAI評分的影響 與對照組相比，模型組大鼠DAI評分升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，加味柴芍六君顆粒低、中、高劑量組DAI評分均下降且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

2.3加味柴芍六君顆粒對大鼠結腸組織中MPO的影響 與對照組〔(0.20±0.07)U/g〕相比，模型組大鼠結腸組織中MPO活性明顯升高〔(0.43±0.08)U/g，P<0.05〕；與模型組相比，加味柴芍六君顆粒低、中、高劑量組大鼠結腸組織中MPO活性均明顯下降且呈劑量依賴性〔(0.32±0.05)U/g、(0.28±0.06)U/g、(0.22±0.03)U/g，P<0.05〕。

2.4加味柴芍六君顆粒對大鼠結腸組織中MEK、ERK、MLCK mRNA的影響 與對照組相比，模型組大鼠結腸組織中MEK、ERK、MLCK mRNA表達明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，加味柴芍六君顆粒低、中、高劑量組大鼠結腸組織中MEK、ERK、MLCK mRNA表達明顯降低呈劑量依賴性(P<0.05)。見表3。

表3 加味柴芍六君顆粒對大鼠結腸組織中MEK、ERK、MLCK mRNA表達的影響

2.5加味柴芍六君顆粒對大鼠結腸組織中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白表達的影響 與對照組相比，模型組結腸組織中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，加味柴芍六君顆粒低、中、高劑量組結腸組織中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白表達明顯降低，呈劑量依賴性(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 加味柴芍六君顆粒對大鼠結腸組織中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白表達的影響

圖3 Western印跡法檢測結腸組織中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白表達

3 討 論

UC是一種發生于結直腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎性疾病，主要病理表現為結直腸組織黏膜充血、水腫、糜爛，出現潰瘍，病灶在組織中連續分布，患者主要表現出腹痛、腹瀉、黏液膿血便等癥狀〔11〕。西藥治療UC主要以抗炎抗免疫治療為主，常用的藥物為糖皮質激素、類固醇激素、水楊酸制劑及免疫抑制劑等，臨床療效尚可，但病情容易復發，長期服用以上藥物有嚴重的副作用〔12〕。中醫認為UC患者肝脾不和是關鍵，以脾虛為本，濕熱、肝郁、血疲為標，整體表現為氣滯血瘀，加味柴芍六君顆粒疏肝解郁、理氣健脾，起活血祛瘀之功，預計可用來治療UC。本文結果說明UC大鼠結腸組織發生炎癥反應，出現黏膜充血、水腫、糜爛等病理癥狀，加味柴芍六君顆?？梢越档蚒C大鼠結腸組織的炎癥反應，改善結腸組織黏膜充血、水腫、糜爛等病理癥狀，降低DAI、HI評分及MPO活性，揭示加味柴芍六君顆?？梢灾委烾C，且療效較好。

腸黏膜屏障是由腸黏膜上皮細胞、細胞間緊密連接等組成的機械屏障。UC患者大都腸黏膜屏障損害加重，是感染和啟動腸道炎癥的關鍵環節〔13〕。MLCK磷酸化信號通路通過介導TJ功能調控腸黏膜屏障〔14〕。MLCK是一種蛋白激酶，依賴于Ca2+/CaM〔15〕。Ca2+/CaM復合體結合MLCK，使其磷酸化激活形成p-MLCK，p-MLCK磷酸化肌球蛋白輕鏈(MLC)的Ser19和Thr18位點，改變MLC 的空間構象，引起肌動蛋白及肌球蛋白絲收縮，使結直腸黏膜上皮細胞的TJ開放，調節上皮細胞黏膜通透性，因此，MLCK在腸黏膜屏障的損傷與修復過程中有重要作用〔16,17〕。研究表明，抑制MLCK可以下調其磷酸化水平，修復腸黏膜屏障并恢復其功能〔18〕。MEK-ERK信號通路可以通過調控MLCK的磷酸化影響上皮細胞的TJ功能，進而調控黏膜的通透性〔19〕。本文結果說明UC大鼠結腸組織中MEK-ERK-MLCK信號激活，各信號因子表達上調，加味柴芍六君顆?？梢砸种芃EK-ERK-MLCK信號，下調各信號因子表達，表明加味柴芍六君顆?？赡苁峭ㄟ^調節MEK-ERK-MLCK信號通路治療UC。