厄貝沙坦通過抑制IRAK1介導p38MAPK信號通路對高糖誘導的腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響

高蘭 劉海蔚 紀群

(海南省人民醫院內分泌科，海南 ?？?570100)

糖尿病腎病是糖尿病全身微血管并發癥之一，已成為引起終末期腎病的重要原因，也是導致糖尿病患者死亡的首位原因，嚴重危害人類健康〔1〕。糖尿病腎病是遺傳因素、氧化應激、高血糖等多因素共同作用的結果，其中高血糖是引起糖尿病腎病的始動因素，控制血糖藥物可以降低高血糖對腎臟的損傷作用，從而延緩腎衰竭進展〔2～4〕。

厄貝沙坦是血管緊張素Ⅱ受體抑制劑，常用于原發性高血壓、合并高血壓的2型糖尿病腎病的治療，對合并糖尿病患者的心、腦、腎功能具有保護作用，近年來被廣泛用于糖尿病腎病的聯合治療，取得了顯著療效〔5～7〕。相關研究報道〔8〕，厄貝沙坦能夠減輕糖尿病腎病氧化應激，改善腎微循環障礙，從而保護腎功能，減輕蛋白尿。但目前，有關厄貝沙坦保護腎功能的作用機制尚未見報道。本研究以人近端腎小管上皮細胞HKC為研究對象，體外探討厄貝沙坦對高糖誘導的腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響及其潛在作用機制，旨在闡明厄貝沙坦對糖尿病腎病的腎保護機制。

1 材料與方法

1.1實驗細胞和主要試劑 人近端腎小管上皮細胞HKC由中國科學院上海細胞庫提供；厄貝沙坦購自浙江華海藥業股份有限公司(批號：20160202)；胎牛血清購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司；DMEM培養基購自Gibco公司；胰蛋白酶購自上海第一生化藥業有限公司；噻唑藍(MTT)試劑和二甲亞砜購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA裂解液購自碧云天生物技術研究所；白細胞介素-1復體激活激酶(IRAK1)抗體、p-p38抗體、p38抗體、β-actin抗體及二抗購自上海艾博抗貿易有限公司；ECL化學發光液購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin-V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司。

1.2細胞培養及分組 將人近端腎小管上皮細胞接種于用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37℃，5%CO2培養箱中常規培養，待細胞生長密度達80%～90%時，用0.25%胰酶消化收集細胞，進行傳代培養。取第4～5代細胞，待細胞生長密度達70%左右時，更換無血清的培養基饑餓培養12 h。將細胞隨機分為對照組(在含正常糖濃度5.5 mmol/L的培養基上培養)、高糖組(HG組，在含糖濃度30 mmol/L的培養基上培養)和高糖+厄貝沙坦組〔糖濃度30 mmol/L培養+厄貝沙坦低濃度(10-6mol/L)、中濃度(10-5mol/L)、高濃度(10-4mol/L)處理〕。

1.3細胞轉染、分組 將HG組細胞隨機分為4組，HG+si-con組〔將小干擾RNA陰性對照組(si-con)轉染至細胞后，在含糖濃度30 mmol/L的培養基上培養〕，HG+si-IRAK1組〔將IRAK1的小干擾RNA(si-IRAK1)轉染至細胞后，在含糖濃度30 mmol/L的培養基上培養〕，HG+pcDNA+厄貝沙坦組〔將pcDNA3.1空載體轉染至細胞后，在含糖濃度30 mmol/L的培養基上培養，并給予厄貝沙坦濃度處理〕，HG+pcDNA-IRAK1+厄貝沙坦組〔將pcDNA-IRAK1轉染至細胞后，在含糖濃度30 mmol/L的培養基上培養，并給予厄貝沙坦濃度處理〕。細胞轉染方法嚴格按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行。

1.4MTT實驗檢測細胞增殖活性 細胞處理48 h后，用0.25%胰酶消化收集細胞，重懸細胞并調整細胞密度為2×104個/ml，接種于96孔板中，每組設置5個重復孔，細胞貼壁后每孔加入20 μl MTT試劑(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，吸去培養孔上層液體，每孔加入150 μl二甲亞砜，放在搖床上反應10 min。酶標儀下檢測每孔490 nm波長處的光密度值(OD 490)，檢測細胞增殖活性。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡率 調整“1.4”中細胞懸液密度為5×105個/ml，取1 ml細胞懸液加入無菌離心管中，2 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次。采用Annexin-V-FITC和PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡率，首先用1×倍結合緩沖液重懸細胞，然后分別加入5 μl Annexin-V-FITC和5 μl PI混勻，室溫，避光反應15 min，流式細胞儀下計數細胞凋亡率。

1.6Western印跡 收集上述各組對數生長期細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白樣品濃度并進行定量，將蛋白樣品和上樣緩沖液按1∶5比例混合，100℃變性5 min，用于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的蛋白。濕轉法轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉中封膜2 h，然后加入稀釋1 000倍IRAK1抗體、p-p38抗體、p38抗體和β-actin抗體一抗，4℃孵育過夜。洗膜，然后加入稀釋2 000倍辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育2 h。洗膜，加入ECL化學發光液中顯色，凝膠成像系統中曝光、拍照，應用ImageJ軟件分析蛋白灰度值并計算IRAK1、p-p38、p38蛋白相對表達水平。

1.7統計學方法 應用SPSS19.0統計學軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度厄貝沙坦對高糖誘導腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響 與對照組比較，HG組細胞增殖活性明顯降低，細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；與HG組比較，厄貝沙坦各處理組細胞增殖活性明顯增加，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；厄貝沙坦中濃度和高濃度組細胞增殖活性明顯高于低濃度組，細胞凋亡率明顯低于低濃度組(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 流式細胞術檢測腎小管上皮細胞凋亡率

表1 不同濃度厄貝沙坦對高糖誘導腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響

2.2不同濃度厄貝沙坦對高糖誘導腎小管上皮細胞IRAK1表達和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的影響 與對照組比較，HG組細胞中IRAK1、p-p38蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，p38蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與HG組比較，厄貝沙坦各處理組細胞中IRAK1、p-p38蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，p38蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；厄貝沙坦中濃度和高濃度組細胞中IRAK1、p-p38蛋白表達水平明顯低于低濃度組(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測腎小管上皮細胞IRAK1表達和p38蛋白表達

表2 不同濃度厄貝沙坦對高糖誘導腎小管上皮細胞IRAK1表達和MAPK信號通路蛋白表達的影響

2.3沉默IRAK1表達對高糖誘導腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響 與HG+si-con組比較，HG+si-IRAK1組細胞中IRAK1蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，細胞增殖活性明顯升高(P<0.05)，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 Western印跡檢測腎小管上皮細胞IRAK1表達

表3 沉默IRAK1表達對高糖誘導腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響

2.4沉默IRAK1表達對高糖誘導腎小管上皮細胞MAPK信號通路的影響 與HG+si-con組比較，HG+si-IRAK1組細胞中p-p38蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，p38蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4、表4。

圖4 Western印跡檢測腎小管上皮細胞p38蛋白表達

表4 沉默IRAK1過表達對高糖誘導腎小管上皮細胞MAPK信號通路的影響

2.5厄貝沙坦和IRAK1過表達對高糖誘導腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響 因厄貝沙坦中濃度(10-5mol/L)和高濃度(10-4mol/L)對高糖誘導的腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響無明顯差異，故選擇厄貝沙坦中濃度進行后續實驗。與HG+厄貝沙坦+pcDNA組比較，HG+厄貝沙坦 + pcDNA-IRAK1組細胞中IRAK1蛋白表達明顯升高(P<0.05)，細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)，細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。見圖5、表5。

2.6厄貝沙坦和IRAK1過表達對高糖誘導腎小管上皮細胞MAPK信號通路的影響 與HG+厄貝沙坦+pcDNA組比較，HG+厄貝沙坦+pcDNA-IRAK1組細胞中p-p38蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，p38蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表5、圖6。

1～4：HG組、HG+厄貝沙坦組、HG+厄貝沙坦+pcDNA組、HG+厄貝沙坦+pcDNA-IRAK1組；圖6同圖5 Western印跡檢測腎小管上皮細胞IRAK1表達

表5 厄貝沙坦和IRAK1過表達對高糖誘導腎小管上皮細胞增殖和凋亡、MAPK信號通路的影響

圖6 Western印跡檢測腎小管上皮細胞p38蛋白表達

3 討 論

腎小球上皮細胞是構成腎小球濾過膜的重要組成部分，其增殖和凋亡平衡是維持腎小球微環境穩定的重要保障，對腎臟功能非常重要〔9〕。高糖可引起腎小球上皮細胞凋亡和增殖抑制，促進糖尿病腎病進展。本研究結果說明厄貝沙坦能夠保護高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷。IRAK1是先天免疫的重要信號傳導介質，可通過激活相關信號途徑在促炎癥反應中發揮重要作用〔10～12〕。本研究結果說明靶向IRAK1對高糖誘導的腎小球上皮細胞損傷有保護作用，可能改善糖尿病腎病炎癥反應。腎纖維化是糖尿病腎病的主要特征之一，研究表明，高糖刺激可通過激活蛋白激酶C、葡萄糖氧化磷酸化等途徑，導致活性氧產生過多，使腎臟固有細胞發生氧化應激，進而激活p38MAPK信號通路等，促進炎癥因子和致纖維化細胞因子的表達，導致腎纖維化形成〔13～15〕。本研究結果說明厄貝沙坦能夠抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞中p38MAPK信號通路激活，可能具有改善糖尿病腎病腎纖維化的作用。

IRAK1蛋白激活介導信號轉導通路在糖尿病腎病發生發展中發揮重要作用〔16〕。本研究結果提示厄貝沙坦對高糖誘導的腎小球上皮細胞的保護作用可能與IRAK1及p38MAPK通路有關。Jeong等〔17〕報道，IRAK1在2，3，4-三硝基苯磺酸誘導的小鼠結腸炎細胞中被活化，而抑制IRAK1活性，可通過抑制NF-kB活性和p38磷酸化改善結腸炎。Awasthi等〔18〕報道，氧化低密度脂蛋白通過激活TLR-PKC-IRAK-MAPK信號途徑誘導中性粒細胞胞外陷阱形成。提示在炎癥性疾病和免疫性疾病中IRAK1活性增強可通過介導MAPK信號通路激活而發揮作用。本研究結果發現，沉默IRAK1后明顯降低了高糖誘導的腎小管上皮細胞中p38磷酸化水平。相關研究報道，抑制腎組織中p38MAPK信號通路活性，可通過抑制炎癥因子和至纖維化細胞因子表達，改善糖尿病腎病小鼠腎纖維化狀態〔19，20〕。本研究進一步探究發現，IRAK1過表達逆轉了厄貝沙坦對高糖誘導的腎小球上皮細胞增殖、凋亡及p38磷酸化的影響，推測厄貝沙坦可能通過抑制IRAK1/p38MAPK信號通路，對高糖誘導的腎小球上皮細胞損傷起保護作用。此外，有研究報道〔21〕，抑制IRAK1活性還可通過PI3K/Akt信號通路降低糖尿病腎病足細胞凋亡，減緩糖尿病腎病進展。

綜上，厄貝沙坦能夠有效抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡，增強細胞增殖活性，可能通過抑制IRAK1/p38MAPK信號通路，發揮抗炎、抗凋亡、抗腎纖維化及促進增殖的作用，從而保護腎臟功能。本研究結果為厄貝沙坦在糖尿病腎病治療中的應用提供了理論基礎，但厄貝沙坦的潛在毒性作用有待于進一步探討。