基于leptin-AMPK-ACC通路探究西格列汀對2型糖尿病大鼠糖脂代謝的改善作用

喬鵬 朱亮 張華 馬妍菁 王曉暉

(蘇州大學附屬第二醫院藥劑科，江蘇 蘇州 215004)

糖尿病是一組因胰島素絕對或者相對分泌不足、胰島素利用障礙引起的碳水化合物、蛋白質、脂肪代謝紊亂性疾病，主要標志為高血糖〔1，2〕。其臨床癥狀為多飲、多尿、多食和體重下降〔3〕。病程過久會引起系統損害，導致眼、腎、神經、血管等組織器官發生慢性進行性病變功能減退等不良癥狀。糖尿病主要包括1型糖尿病和2型糖尿病(T2DM)〔4，5〕。據國際糖尿病聯盟統計顯示，我國糖尿病患者居世界首位，其中T2DM患者占我國糖尿病患者95%以上，其病因多為胰島素抵抗、胰島素進行性分泌不足或二者兼有〔6〕。因此尋找一種治療T2DM的方法具有重要意義。西格列汀作為二肽基肽酶-4抑制劑，可單獨應用或與其他降糖藥組成復方藥物治療T2DM。西格列汀具有一定的安全性，能夠減少低血糖及體重增加的不良發生率〔7〕。本研究探究西格列汀對T2DM模型大鼠糖脂代謝的改善作用及對瘦素(leptin)-腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-乙酰輔酶A羧化酶(ACC)通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料 選取SD健康雄性大鼠(江蘇大學動物實驗中心)40只，體重180～230 g，平均(194.75±33.48)g。放在18～26℃下，濕度45%～55%的干凈籠子喂養，飲水和新鮮干燥的飼料均進行消毒之后供其自由食用。高糖高脂飼料成分為：15%蔗糖，20%豬油，3%蛋黃，62%基礎飼料。主要試劑：兔抗小鼠空腹胰島素(FINS)、三酰甘油(TG)抗體(Selleck公司)；1∶50兔抗鼠糖化血紅蛋白(HbA1c)抗體(博士德生物工程有限公司)；大鼠抗小鼠Leptin、AMPK、ACC抗體(Hyclone公司)。

1.2方法

1.2.1T2DM模型制作 除正常對照組(10只)大鼠外，其他大鼠在自由飲水和攝食1 w后，采用高糖高脂飼料喂養進行造模：T2DM模型組、西格列汀組、二甲雙胍對照組均對大鼠投放高糖高脂飼料，喂養1個月后禁食12 h，隨后對模型大鼠空腹腔注射35 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)溶液，大鼠靜脈抽血1 ml測定空腹血糖(FBG)，以FBG≥1.90 mmol/L來判定造模成功。最終建模成功大鼠26只，隨機分組為T2DM模型組8只，西格列汀組9只，二甲雙胍對照組9只。

1.2.2取材 西格列汀組灌胃給藥30 mg/kg，二甲雙胍對照組腹腔注射給藥100 mg/kg，T2DM模型組與正常對照組均給予30 ml/kg生理鹽水。每天清晨灌胃給藥，連續給藥1個月后處死，取腹主動脈血5 ml，離心分離血清與血漿。

1.2.3空腹FINS、TG測定 采用放射免疫法測量血清中FINS：加入適量緩沖液、乙二胺四乙酸(EDTA)溶液、標準液和標志物抗血清，震混搖勻在4℃下放置24 h。取出后加入免疫分離劑，在4℃下放置15 min，離心后棄上清液，測沉淀物放射性計數。采用酶比色法測定TG。

1.2.4FBG、HbAlc測定 使用HbA1c分析儀測定HbAlc時，應嚴格遵守儀器操作制度。采用酶法測定FBG：取1份洗滌過后的紅細胞，加入1%酶液，放置37℃水浴溫育15 min，用生理鹽水洗滌處理過的細胞3次，配成2%～5%的紅細胞懸液1滴加入血清放置37℃溫育10 min，離心后觀察凝集反應。

1.2.5總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定 使用酶比色法檢測：稱取5 g TC、LDL-C、HDL-C、內脂素(Visfatin)、抵抗素(Resistin)、脂聯素(APN)置于50 ml容量瓶中，加入1 ml甲苯處理，加入5 ml 10%的尿素液與10 ml的檸檬酸鹽緩沖液，隨后放在37℃環境下培養1 d，用高溫蒸餾水進行稀釋，將懸液過濾。取1 ml過濾液使用蒸餾水稀釋后加入5 ml苯酚鈉溶液，隨即再加入3 ml次氯酸鈉溶液搖勻。30 min后檢測TC、LDL-C、HDL-C、Visfatin、Resistin、APN值。

1.2.6Leptin、AMPKα、ACC測定 使用磷酸鹽緩沖液(PBS)對標本沖洗后裂解30 min，測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質，添加蛋白緩沖液后進行電泳，10 min后將電轉膜置于10%的牛奶中浸泡，常溫環境下封閉90 min。之后結合一抗、稀釋，孵育1 d，取出后使用TBST緩沖液沖洗，結合二抗，60 min后清洗、顯色，對蛋白Leptin、AMPKα、ACC表達進行檢測。

1.2.7使用蘇木素-伊紅(HE)染色對大鼠肝臟組織檢測 對各組大鼠進行全麻處死，取肝臟組織，液氮冷凍后常規脫水、透明、石蠟包埋，間距5 mm做連續切片。將切片烤干后進行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中各復水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗后使用1%伊紅染色，使用酒精脫水處理后進行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡觀察。

1.2.8使用反轉錄(RT)-聚合酶鏈反應(PCR)檢測各組大鼠肝臟、腎臟組織內leptin mRNA、AMPKα mRNA、ACC mRNA的表達 提取液氮冷凍的大鼠肝臟、腎臟組織，隨后加入1 ml Trizol研磨成粉末狀，按照制備試劑盒說明書提取大鼠肝臟、腎臟組織中的總RNA，對RNA的純度和含量檢測，然后使用Takara逆轉錄試劑盒行逆轉錄處理后獲得cDNA，使用Primer5.0軟件對引物序列進行設計，最后使用RT-PCR方法檢測大鼠肝臟、腎臟組織中leptin mRNA、AMPKα mRNA、ACC mRNA的表達量，采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的leptin mRNA、AMPKα mRNA、ACC mRNA表達量。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組肝臟組織HE染色 正常對照組肝臟小葉結構清晰，呈索狀排列，未見腫脹。T2DM模型組肝臟細胞排列順序紊亂，出現大量脂肪樣和空泡。二甲雙胍對照組肝臟細胞排列規則，脂肪樣大量減少，空泡排列疏松，密度小。西格列汀組與二甲雙胍對照組比較，肝組織結構并無太大差異。見圖1。

圖1 各組肝臟組織(HE，×200)

2.2各組Visfatin、Resistin、APN水平比較 T2DM模型組Resistin和APN水平均顯著低于其他3組，Visfatin水平顯著高于其他3組(P<0.05)；西格列汀組APN、Resistin水平顯著高于T2DM模型組和正常對照組且Resistin水平顯著低于二甲雙胍對照組，APN水平顯著高于二甲雙胍對照組，Visfatin水平顯著低于T2DM模型組和二甲雙胍對照組且顯著高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組Visfatin、Resistin、APN水平比較

2.3各組FBG、HbA1c、FINS比較 T2DM模型組FBG、HbA1c顯著高于其他3組，FINS低于其他3組(P<0.05)；西格列汀組FBG、HbA1c顯著高于正常對照組，FINS顯著低于正常對照組且顯著高于T2DM模型和二甲雙胍對照組(P<0.05)。二甲雙胍對照組FBG顯著高于正常對照組，顯著低于T2DM模型組、西格列汀組，HbA1c顯著高于正常對照組，顯著低于T2DM模型組和西格列汀組，FINS顯著高于T2DM模型組，顯著低于正常對照組、西格列汀組(P<0.05)。見表1。

2.4各組TC、TG、LDL-C、HDL-C比較 T2DM模型組TC、TG、LDL-C顯著高于其他3組，HDL-C顯著低于其他3組(P<0.05)；西格列汀組TC、TG、LDL-C均顯著高于正常對照組(P<0.05)。二甲雙胍對照組HDL-C顯著低于西格列汀組，TC、TG、LDL-C顯著高于西格列汀組(P<0.05)。見表2。

表2 各組TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較

2.5各組leptin、AMPKα、ACC及mRNA水平比較 T2DM模型組leptin水平顯著高于其他3組，AMPKα水平顯著低于其他3組，ACC水平顯著高于正常對照組且低于西格列汀組、二甲雙胍對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；西格列汀組leptin、ACC顯著高于正常對照組，AMPK顯著低于正常對照組(P<0.05)。

T2DM模型組leptin mRNA、ACC mRNA表達顯著高于其他3組，AMPKα mRNA表達顯著低于其他3組(P<0.05)。二甲雙胍對照組leptin mRNA、ACC mRNA表達顯著低于T2DM模型組、西格列汀組且顯著高于正常對照組，AMPKα mRNA表達顯著高于其他3組(P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 各組leptin、AMPK、ACC水平比較

表3 各組leptin、AMPKα、ACC及mRNA水平比較

3 討 論

T2DM也稱成人發病型糖尿病，多發生于30歲以后〔8〕。其發病機制多為患者體內產生的胰島素過多或減少導致胰島素的作用效果變差從而進一步加重病情〔9〕。研究表明，高熱量飲食、活動量不足、肥胖和增齡是T2DM患者產生的最常見環境因素，高血壓、高脂血癥等因素也會增加患病風險〔10，11〕。與白種人和亞洲黃種人比較，T2DM更易在土著美洲人、非洲人及西班牙人群中發生〔12〕。因此，尋找一種安全、有效治療T2DM的方法有重要意義。

胰島素是一種蛋白質激素，主要由胰臟內的胰島β細胞受內源性或外源性物質刺激分泌而來。是機體內唯一能降低血糖的激素，同時還可促進糖原、脂肪等物質的合成。進行糖尿病治療時主要用外源性胰島素〔13〕。FBG是指在隔夜空腹(飲水除外的8～10 h內未進任何食物)后，早餐前采取血液檢測出來的血糖值，多用于檢測糖尿病，反映胰島β細胞功能〔14〕。HbA1c為紅細胞中的血紅蛋白與血清中的糖類相結合的產物，是通過緩慢、持續及不可逆的糖化反應形成，血糖的濃度、血糖與血紅蛋白接觸時間決定了HbA1c在機體內的含量。因此被用作糖尿病控制的監測指標〔15〕。TG為脂肪的組成成分，是由甘油和3個脂肪酸所形成的酯，一般情況下血漿中的TG保持著動態平衡〔16〕。TC為血液中所有脂蛋白所含的膽固醇之和，其合成和儲存的主要器官為肝臟。其血清濃度可以作為脂代謝的指標〔17〕。LDL-C是以脂蛋白的形式存在于血液中，血漿中LDL是運輸內源性膽固醇的主要載體〔18〕。本研究說明西格列汀可調節T2DM模型大鼠體內的FBG、HbA1c、TG、TC、FINS、LDL-C、HDL-C，可有效治療T2DM。

脂肪組織主要是由大量聚集成團的脂肪細胞組成，APN便是其中之一。Resistin是含有108個氨基酸的前肽，它與人體的脂肪生成分化有密切關系。visfatin為內臟脂肪素，主要是由內臟脂肪組織分泌表達并具有多種的生物學活性。本研究表明使用西格列汀可通過調節大鼠體內的APN、Resistin、visfatin水平來治療T2DM模型大鼠，效果顯著。