高靈敏靶標自環化滾環擴增檢測的動態接頭構建?

王晨儒，安 然，2??，梁興國，2

(1．中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003； 2．青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266237)

滾環擴增(Rolling circle amplification，RCA)是指以環狀DNA為擴增模板，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下，擴增產生具有重復序列長鏈DNA的一種等溫擴增技術[1-2]。RCA具有等溫反應、擴增效率高、可進行原位擴增和易與其他技術聯合等優勢，適合應用于微生物的現場檢測和高通量初篩[3-4]。近年來，隨著RCA技術的快速發展，研究者們已開發了針對miRNA[5-6]、病原菌[7-8]、蛋白質[9-10]、毒素[11]甚至重金屬[12-13]等多種物質的RCA檢測技術。此外，RCA還被用于DNA納米結構的構建、藥物載體的制備[14-16]和生化分析等領域[17-19]。

為使RCA可檢測線性DNA靶標，大多RCA技術通過鎖式探針將線性靶標轉化為環狀模板。鎖式探針兩端分別與靶標片段互補配對，并在靶標的輔助下環化，然后DNA聚合酶以環化的鎖式探針為模板進行擴增[3,8]。然而，這種方法的實質是對人為加入的鎖式探針進行擴增，并非真正擴增靶標片段，因此存在特異性較差、假陽性率高等問題。針對此問題，Wang等[18,20]建立了一種將靶標環化的新型RCA技術，稱為靶標自環化滾環擴增(Target-circularization RCA，TC-RCA)。具體原理是通過IIS型限制性內切酶(產生隨機黏性末端)切割目標基因，產生兩端具有不同黏性末端的靶標片段；再利用可與靶標黏性末端互補配對的特異性接頭(兩條部分互補的單鏈DNA雜交形成的帶有黏性末端的接頭)捕獲靶標片段，并在連接酶的作用下使靶標環化為帶有缺口(Gap)的雙鏈環狀DNA；最后以此缺口的3’端為引物進行RCA(見圖1a)。TC-RCA是直接對靶標片段的擴增，特異性得到顯著提高，并可用于全基因組擴增、基因測序等領域。

然而，TC-RCA在均相體系中的檢測靈敏度僅為6×106copies/μL，難以進一步提高。分析原因如下：為使接頭在大量背景基因中快速捕獲微量靶標，通常接頭的加入量是靶標的102～109倍[18]；因此，過量的雙鏈接頭極易同時雜交于靶標兩端，導致大部分靶標片段無法環化為環狀模板，大大降低了RCA效率(見圖1b)。

為確定TC-RCA靈敏度低的原因并提高檢測效率，本研究構建了一種帶有發卡結構的動態接頭(18 nt)，使接頭的兩端產生連接活性差異，通過發卡接頭打開與閉合的動態平衡抑制靶標兩端雙鏈接頭的同時連接。通過研究發卡動態接頭的環化效率以及發卡的穩定性和磷酸化對連接的影響，揭示了TC-RCA靈敏度低的根本原因。在此基礎上，本研究采用了一種10 nt的短鏈動態接頭進一步提高了環化效率，實現TC-RCA靶標的高靈敏度環化。新型動態接頭的構建為TC-RCA中接頭的設計提供了新思路，可大大提高TC-RCA的檢測靈敏度；同時可為雙鏈DNA環化機理研究提供重要參考。

(a：靶標自環化RCA(TC-RCA)技術；b：兩接頭同時連接于靶標兩側，導致靶標無法環化，繼而無法進行RCA。a: the principle of target-circularization RCA (TC-RCA). b: the problem that two adaptors are connected, resulting in the failure of cyclization as well as RCA.)

1 實驗方法

1.1 試劑與材料

DNA序列由金唯智(蘇州)合成(見表1)。TaqDNA連接酶、TspRI限制性內切酶及ATP購自英國New England Biolabs(NEB)公司；Eva Green qPCR Mix(2×)購自美國Biotium公司；T4 DNA ligase和瓊脂糖膠純化試劑盒等均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 發卡動態接頭連接線性靶標(W或P)

1.2.1 發卡動態接頭單側與靶標連接 在含有0.1 μmol/L的線性靶標W(或P)體系中添加其中一個發卡動態接頭(Ha或Hb)0.1 μmol/L，8 UTaqDNA ligase，1×TaqDNA Buffer，總體積為10 μL。實驗平行進行2次以上。55 ℃溫育6 h。10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測連接產物。

1.2.2 發卡動態接頭雙側與靶標連接 在含有線性靶標W(0.2 μmol/L)和P(0.1 μmol/L)的體系中添加Ha(0.1 μmol/L)和Hb(0.2 μmol/L)發卡動態接頭，8 UTaqDNA ligase，1×TaqDNA Buffer，總體積為10 μL。實驗平行進行2次以上。55 ℃溫育6 h。10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測連接產物。

表1 寡核苷酸序列

1.3 發卡動態接頭連接271 bp靶標DNA

1.3.1 靶標單側連接發卡接頭 在10 μL體系中，加入靶標DNA(濃度可以為10 nmol/L～10 amol/L)，一對發卡動態接頭(終濃度10 nmol/L)，8 UTaqDNA ligase，1×TaqDNA Buffer(10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA，200 μg/mL BSA，50% Glycerol，pH=7.4, 25 ℃)。實驗平行進行3次。55 ℃溫育6 h。采用實時熒光定量PCR法檢測產物濃度。

1.3.2 靶標雙側連接發卡接頭 在反應體系中同時加入相同體積和濃度的兩對發卡接頭(H1a+H1b或H2a+H2b)，其余條件及操作與上述只有一對接頭單側連接相同。

1.4 短鏈動態接頭環化558 bp靶標

在含有558 bp靶標DNA(10 nmol/L～10 amol/L)的10 μL反應體系中添加一對短鏈接頭(10 nmol/L)，2.5 U T4 DNA ligase，1×T4 DNA Buffer。實驗平行進行3次。25 ℃溫育6 h。采用實時熒光定量PCR法檢測產物濃度。

1.5 實時熒光定量PCR分析動態接頭的連接產率

將1 μL連接產物加入含有0.4 μmol/L引物和1×Eva Green qPCR Mix的10 μL反應體系中進行熒光定量PCR。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，75 ℃ 1 min (30循環)；75 ℃ 5 min終止延伸。

2 結果與討論

2.1 環化靶標DNA的發卡動態接頭設計

構建的發卡動態接頭如圖2a所示，雙鏈莖干區長3 bp，帶有9 nt長的3’端凸出末端。其特點是在溶液中處于打開與閉合的動態平衡：當發卡形成時，可在連接酶作用下以黏性末端的方式連接到靶標上，而且由于發卡結構莖干區很短，其5’端不發生連接；當發卡打開為單鏈結構時，也難以連接[21]。Yu等研究發現[21]，黏性末端的連接效率顯著高于同等長度單鏈的連接。只有當單鏈接頭分別連接到靶標后，才能形成黏性末端(9 nt互補)并完成環化。值得注意的是，未發生連接時，由于互補部分很短，在連接溫度下難以雜交，避免生成雙鏈接頭，造成兩端同時發生雙鏈連接。兩端單鏈連接后形成了9 nt的黏性末端，可在連接酶的輔助下雜交并連接。此外，環化是分子內連接，連接效率大大高于形成二聚物的分子間連接。由于其中一個發卡接頭的5’端未進行磷酸化，因此靶標環化后形成一條鏈具有切口的雙鏈環狀DNA，聚合酶以此切口為引物進行RCA反應(見圖2b)。

為驗證上述設計思路，即避免雙鏈接頭的形成與連接，本研究在Wang[18,20]等的研究結果基礎上，設計了發卡接頭用來環化TspRI酶切的靶標[22]。為形成相對穩定的發卡，將一個接頭的環部序列設計為5’-GAA-3’[24]，另一個發卡接頭的環部序列為5’-TTC-3’(見圖2a)。

(a：發卡接頭的設計原理；b：發卡接頭連接靶標的原理。a: The design principle of hairpin adaptors. b: The principle of the target circulization with hairpin adaptors.)

2.2 發卡接頭連接效率比較

為了減少對發卡接頭連接效率評價的影響，設計了如圖3a所示的連接體系。將4條單鏈DNA通過互補雜交形成2條帶有3’凸出末端的雙鏈DNA(W和P)。其中W由Wa(79 nt)和Wb(55 nt，5’端磷酸化)構成，含有55 bp雙鏈且兩端分別有15和9 nt單鏈凸出端；P由Pa(79 nt)和Pb(47 nt，5’端磷酸化)構成，含有47 bp雙鏈且兩端分別有23和9 nt的單鏈部分。W與發卡接頭H1b互補(5’端未磷酸化)；P與H1a互補(5’端已磷酸化)。

圖3c為TaqDNA ligase在55 ℃下連接發卡接頭與W和P(0.1 μmol/L)的結果。W與H1b連接后形成“15 nt單鏈+64 bp雙鏈+9 nt單鏈”的結構；P與發卡接頭H1a連接后將形成“23 nt單鏈+56 bp雙鏈+9 nt單鏈”的結構(見圖3b)。結果表明，W與H1b(Lane 3)和P與H1a(Lane 4)連接后均可獲得濃度較高的單一條帶產物，說明發卡結構可分別與單側靶標發生高效連接。然而，連接產物條帶與W和P原條帶位置極其接近，這可能是由于W與H1b、P與H1a連接后，發卡的5’端仍可回折形成雙鏈發卡結構，而W和P模板的3’端則具有凸出的9 nt單鏈末端，較為舒展的單鏈DNA末端會減慢DNA在電泳凝膠中的遷移速率[25]。

(a：線性靶標模板以及發卡接頭示意圖；b：線性靶標與發卡接頭連接的三種連接產物；c：連接結果電泳圖。a: The scheme of linear targets and hairpin adaptors. b: Three kinds of ligation products of linear targets and hairpin adaptors. c: The ligation results.)

然后我們將W、P、H1a和H1b同時添加至連接體系中，以探索發卡接頭是否可在與W和P分別連接后進行黏性末端的連接。若連接成功，將形成W+Hb+Ha+P(見圖3b(3))的雙鏈DNA結構(15 nt單鏈+129 bp雙鏈+23 nt單鏈，且具有一個切口)。圖3c中Lane 5為W+Hb+Ha+P的連接結果，圖中可看出產生了較長的雙鏈DNA產物且產物濃度較高，說明發卡接頭可發生高效連接。同時，這一結果也進一步說明發卡接頭優先與線性靶標的一側發生連接，然后再完成接頭間的連接。同樣，與類似長度的Ladder相比，雙鏈DNA產物遷移率較慢的原因是雙鏈兩端的單鏈末端減慢了DNA在凝膠中的遷移速率。此外，連接中有少量副產物產生，可能是由于W濃度較高，少量H1b接頭也連接到了W上。為了便于評價連接效率，加入的W是P的2倍，因此有H1a與W連接后的產物剩余。

2.3 發卡動態接頭的穩定性對連接的影響

發卡結構的穩定性是影響發卡接頭與靶標連接的關鍵因素。根據Wang等[23-24]的研究成果，環部序列為5’-GNA-3’的發卡結構穩定性遠高于其他序列。如環部序列為5’-GAA-3’的發卡的Tm比環部為5’-AAG-3’的發卡高10℃以上。因此，本部分重新設計了環部序列為5’-AAG-3’和5’-CTT-3’的一組發卡接頭H2a與H2b，與2.2中環部序列為5’-GAA-3’和5’-TTC-3’的發卡接頭H1a和H1b進行對比。此外，為探究發卡接頭磷酸化對連接的影響，分別選用了5’端磷酸化的發卡接頭和5’端未磷酸化的發卡接頭進行了對比。

當進行單側連接時，5’端磷酸化的發卡接頭與靶標連接后可獲得較為單一的產物(見圖4，Lane 3、5、7和9)，說明發卡接頭與靶標發生了高效連接且接頭的穩定性對連接效率影響較小。對于5’未磷酸化的發卡接頭，自身穩定性較高的H1發卡接頭與靶標的連接結果與磷酸化接頭的結果相似，可產生條帶位置相同的單一產物。然而，對于自身穩定性較低的H2發卡接頭，其與靶標連接后產生了一條遷移率較慢的連接產物。原因是未磷酸化的H2a和H2b發卡接頭穩定性較低，在電泳過程中打開形成單鏈，導致遷移率降低。當進行雙側連接時，發卡接頭的穩定性以及是否含有磷酸基對連接效率影響較大。結果顯示，當H2a磷酸化、H2b未磷酸化時，與靶標連接后剩余底物最少(Lane 13)，說明連接效率最高?？赡艿脑蚴欠€定性較低的H2a和H2b更易打開進行互相連接；而對于熔點較高的H1a和H1b，較難打開從而導致雙側連接的產率較低。

圖4 發卡接頭穩定性及磷酸化對連接靶標的影響

2.4 發卡動態接頭連接靈敏度評價

本部分選取了高濃度靶標下連接效率較高的H2a和H2b發卡接頭，精準評價H2a和H2b發卡接頭對痕量靶標的連接情況。采用熒光定量PCR法測定接頭與靶標連接后的產物量，從而對發卡接頭的連接效率和環化靶標的靈敏度進行評價。具體原理是采用pUC18質粒中的271 bp雙鏈DNA作為靶標(末端具有9 nt凸出的黏性末端)，將靶標稀釋至不同濃度后與發卡接頭連接，然后利用熒光定量PCR檢測連接產物，通過Ct值評價連接產物的含量。單側連接后進行PCR時，位于發卡側的下游引物3’端與靶標僅互補3 bp，剩余序列與發卡接頭序列相同(見圖5a)。因此，僅當發卡接頭與靶標成功連接后才可發生PCR擴增。針對H2a單側連接產物的PCR引物為F-H2a和R-H2a，針對H2b單側連接產物的PCR引物為F-H2b和R-H2b(序列見表1)。當雙側連接時，發卡接頭可將271 bp的靶標連接為環狀雙鏈DNA，PCR的引物設計于發卡接頭兩側的靶標區。若雙側連接成功，則可跨越接頭發生PCR擴增；若雙側連接未成功，則擴增區域不連續，無法發生PCR。雙側連接產物的PCR引物為F-271和R-271(見表1)。

圖5b中分別表示了不同濃度靶標(103～109copies/μL)與H2a或H2b的單側連接結果及靶標與H2a+H2b的雙側連接結果。結果顯示，發卡動態接頭與靶標連接后可成功擴增，且空白組無Ct值(數據未列出)，說明發卡接頭可以成功對痕量靶標進行單側連接和雙側連接。隨著靶標濃度的降低，Ct值均逐漸升高，說明連接產物量逐漸減少。單側連接時，靶標濃度降低至105copies/μL以下Ct值不再變化，說明發卡接頭單側連接的靈敏度達105copies/μL。雙側連接時，靶標濃度低于106copies/μL時無法獲得Ct值，說明發卡動態接頭環化靶標的靈敏度為106copies/μL。

上述結果證實，發卡動態接頭可通過使靶標兩端產生連接活性差異提高靶標的環化靈敏度。而傳統雙鏈接頭連接靶標兩黏性末端的活性基本一致，在黏性末端長度為9 nt時，雙鏈接頭連接靶標兩端難以形成一定的先后性。因此，傳統TC-RCA靈敏度低的原因極有可能是兩個雙鏈接頭同時占據靶標兩端，且同種接頭間無法互補配對，繼而影響靶標環化。

(a：單側連接產物的PCR擴增方案；b：H2a、H2b與271 bp靶標連接后的熒光定量PCR結果。a: The PCR scheme of one-side ligation products. b: The RT-PCR results of the ligation products of 271 bp target with H2a and H2b.)

2.5 短接頭環化558 bp靶標DNA

為進一步提高靶標環化的靈敏度，本研究又設計了一種長度為10 nt的短鏈動態接頭，期望通過不穩定短鏈接頭增加接頭對靶標兩端的連接活性差異，實現靶標的高靈敏度環化。短鏈接頭的設計為將互補區域縮短至5 bp，且兩端分別有5 nt的黏性末端。較短的互補區域使短鏈接頭的穩定性降低，難以形成雙鏈接頭。又因接頭兩端的黏性末端GC含量不同，導致兩端連接活性具有差異，從而抑制靶標兩端同時連接兩個雙鏈接頭。本部分設計的短鏈接頭互補區域的GC含量為100%，兩端黏性末端為HgaI限制性內切酶的酶切序列(見圖6a)，具體序列見表1。

短鏈動態接頭連接的靶標長度為558 bp，序列也來自pUC18質粒。使用T4 DNA liagse在25 ℃的條件下連接不同濃度靶標并獲得連接產物；隨后，利用引物Ex-558a以及Ex-558b(見表1)進行熒光定量PCR檢測環化后產物濃度。從圖6b中可以看出，在靶標濃度為109～104copies/μL均有環化產物生成，當靶標濃度低于104copies/μL無Ct值測出且空白組也無有效Ct值，說明短鏈接頭環化靶標的靈敏度為104copies/μL。

(a：短鏈接頭的設計圖；b：短鏈接頭環化558 bp靶標DNA的產物進行RT-PCR的結果。a: The design of the short adaptors. b: The RT-PCR results of the circularization products of the target DNA with short adaptors.)

本研究構建了一種新型的發卡動態接頭，探究了對靶標的環化情況，并且研究了發卡接頭的穩定性和磷酸化位置等對接頭環化靶標的影響。最初Wang等[18]設計的傳統雙鏈接頭是由兩條26 nt的單鏈部分互補，形成中間17～19 bp雙鏈、兩端各9 nt單鏈凸出末端的雙鏈結構。17～19 bp的雙鏈結構在連接溫度55 ℃下難以打開，雙鏈接頭與靶標連接時會作為一個整體連接，且雙鏈接頭對于靶標兩端的連接活性幾乎無差異，因此接頭會同時連接到靶標的兩端，導致大多靶標兩端均具有雙鏈接頭而最終無法環化為RCA的環狀模板，致使RCA靈敏度降低。對于發卡動態接頭，由于發卡結構的存在，兩條發卡接頭難以在體系中互補為雙鏈接頭，而是分別與靶標兩端連接，然后在分子內黏性末端連接的優勢下打開并發生環化，這樣可極大程度避免靶標難以環化的問題。本研究設計的發卡接頭最低可連接1×106copies/μL的靶標DNA。通過增大接頭兩端連接活性差異并減少互補部分的長度，改進后的短鏈動態接頭的連接靈敏度可達1×104copies/μL?？梢?，利用結構、互補長度等產生的連接活性差異，可有效避免抑制環化的連接發生。后續還可通過進一步優化接頭設計以及反應條件來提高接頭對靶標的靈敏度。

3 結語

本研究通過探究發卡動態接頭對TC-RCA靶標的環化情況以及發卡靈敏度和磷酸化對連接效率的影響，解釋了TC-RCA靈敏度低的根本原因。即雙鏈接頭分別連接在靶標兩端，導致無法進行環化。此外，通過設計一種新型的短鏈動態接頭進一步提高了靶標的環化靈敏度，達104copies/μL。本研究構建的發卡動態接頭和短鏈動態接頭可應用于雙鏈環狀DNA制備、RCA擴增及基于RCA的基因檢測和全基因組擴增等多個領域。本研究對于完善雙鏈DNA的環化機理、進一步提高TC-RCA的檢測靈敏度具有重要意義，同時對反向PCR等其他生物技術中雙鏈DNA的連接和環化研究也具有很高的參考價值。