重組藻膽蛋白與高等植物類囊體膜之間能量傳遞的研究?

尚孟慧，臧曉南，林嬌嬌，李 瑞，畢 瑩，徐曉婷

(中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

光合真核生物葉綠體中的類囊體膜是光合作用部位，其中含有一些色素-蛋白質復合物作為其結構的組成部分，如PSI和PSII。類囊體膜中的色素可分為三大類：葉綠素、類胡蘿卜素和藻膽蛋白。在這三類中，葉綠素和類胡蘿卜素存在于高等植物中，而藻膽蛋白僅存在于某些藻類中，例如藍藻和紅藻。高等植物類囊體膜上葉綠素，可以吸收在430～450 nm和640～660 nm的兩段范圍內的可見光，不能利用450～650 nm范圍內的可見光[2]。而藻膽蛋白能夠捕捉高等植物無法捕捉的540～650 nm區域內的可見光[2]。藻膽蛋白根據結構組分、藻膽色素的類別以及其吸收光能的特點，分成以下種類：藻紅蛋白(PE，最大吸收光范圍540～570 nm)，藻藍蛋白(PC，最大吸收光范圍610～620 nm)，藻紅藍蛋白(PEC，最大吸收光范圍：560～600 nm)，別藻藍蛋白(APC，最大吸收光范圍650～ 655 nm)。藻膽蛋白的吸收光譜恰好與葉綠素互補，使得藻類植物的光吸收范圍遍布在幾乎整個可見光區域。藻膽蛋白在藻膽體中的組合排列使得光合作用中進行能量傳遞的效率幾乎接近100%[3]。

通常認為光能傳遞的一般途徑為：藻紅蛋白→藻藍蛋白→別藻藍蛋白→葉綠素a。已有研究證明高等植物類囊體膜與藻類藻膽體之間能夠實現光能傳遞，仵小南[4]等通過實驗證明了藻膽蛋白與菠菜類囊體混合孵育后，可以將吸收的光能傳遞給菠菜的光系統I。若與青菜類囊體混合孵育，藻紅蛋白或藻藍蛋白只有通過別藻藍蛋白才能將吸收的光能傳遞給光系統Ⅱ，這與已有的各組分之間在進行光合作用時的能量傳遞規律是相同的。早在1992年Su等[5]就提出了藻膽體棒狀復合物中的藻藍蛋白吸收的光能可直接傳遞給光系統I中的葉綠素a。容壽榆等[6]通過測定藻膽體與菠菜光系統 Ⅱ 的混合溶液的光譜以及溶液的放氧活性，得到的結果表明它們可以進行能量傳遞。因此，天然藻膽蛋白可以與高等植物類囊體進行光能傳遞。若重組藻膽蛋白也能與類囊體進行光能傳遞，將為構建新型光合系統提供依據。

因此本文運用了基因工程方法重組表達藻紅蛋白和藻藍蛋白，與高等植物的類囊體膜混合孵育，驗證重組藻膽蛋白是否可以實現與高等植物類囊體膜之間的光能傳遞，為研究藻膽蛋白與高等植物類囊體膜之間的光能傳遞規律提供新的元件，并為藻膽蛋白在構建新型光合系統中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

采用實驗室前期構建的重組菌株E.coliHPBAEFUST和E.coliEBA-AB。重組菌株E.coliHPBAEFUST中的表達載體為pET24a-hox1(314)-pcyA(314)和pACYCDuet-ucpcBA-cpcEF-cpcU-cpcS-cpcT，包含的基因有節旋藻(Arthrospiraplatensis)的血紅素加氧酶基因hox1和鐵氧還蛋白氧化還原酶基因pcyA(用于合成藻藍膽素)，以及藻藍蛋白α、β亞基基因(用于表達脫輔基藻藍蛋白)以及色基裂合酶cpcEF、cpcU、cpcS和cpcT基因(用于催化脫輔基藻藍蛋白與藻藍膽素的結合)。重組菌株E.coliEBA-AB中表達載體為 pACYCDuet-peB-peA和pET24a-hox1-pebA-pebB，包含的基因有藻紅蛋白 α 亞基和 β 亞基基因(用于表達脫輔基藻紅蛋白)，血紅素加氧酶基因hox1以及鐵氧還蛋白依賴性色素還原酶基因pebA和pebB(用于合成藻紅膽素)。大腸桿菌(E.coliBL21)為空表達菌株。

1.2 重組藻藍蛋白、藻紅蛋白的誘導表達

菌種活化：將重組表達菌株E.coliHPBAEFUST、E.coliEBA-AB和空表達菌株E.coliBL21，37 ℃過夜培養，重組菌株添加抗生素硫酸卡那霉素和氯霉素。

擴大培養：按1∶100的比例轉接，37 ℃擴大培養菌株至OD600≈0.6。

誘導表達：加入誘導劑IPTG(工作濃度是0.1 mmol/L)，重組表達菌株E.coliHPBAEFUST于恒溫培養箱中37 ℃、200 r/min振蕩培養2 h，重組表達菌株E.coliEBA-AB為30 ℃、200 r/min振蕩培養6 h。誘導完成后進行重組藻藍蛋白、藻紅蛋白的提取?？毡磉_菌株E.coliBL21的細胞破碎液作為陰性對照。

1.3 菠菜類囊體、韭菜類囊體的提取

參照陳小全[7]、吳平[8]、張秀君[9]、高歧[10]等方法，將新鮮葉片洗凈擦干，稱取剪碎后的葉片60 g用液氮進行研磨，向研磨后的葉片粉末中加適量 4 ℃預冷的提取緩沖液進行提取。

1.4 吸收光譜檢測

將提取的重組藻紅蛋白、重組藻藍蛋白稀釋至相同濃度后分別與用0.01 mol/L 的PBS溶液重懸的菠菜類囊體膜溶液混合避光孵育，用Nanodrop 2000分別進行全波長吸收光譜掃描。以空表達菌株E.coliBL21的細胞破碎液和菠菜類囊體的混合溶液作為對照。以不同的時間(0、5、10、15、20、25和30 min)進行混合孵育，觀察吸收光譜峰面積圖，確定最適孵育時間；0～10 μL內以每1 μL作為梯度增加樣本中重組藻膽蛋白的濃度，觀察吸收光譜的變化，確定藻膽蛋白濃度與吸收光譜的關系。并將純化的重組藻紅蛋白和重組藻藍蛋白分別按照1∶1、1∶2、2∶1的濃度比，加入到類囊體膜重懸溶液中，混合均勻，按照最佳混合孵育時間進行孵育，然后分別進行全吸收光譜掃描，確定重組藻紅蛋白與藻藍蛋白比例與光能吸收的關系。

1.5 熒光光譜檢測

將1.4所述的重組藻紅蛋白、藻藍蛋白與類囊體膜混合孵育后，使用HITACHIFI-4600型熒光光譜儀進行熒光發射光譜檢測，用430、420和580 nm(分別為葉綠素a、藻紅蛋白、藻藍蛋白的特征熒光峰值處的激發波長)激發波長對樣品進行熒光激發。熒光發射光譜掃描速度1 200 nm/min，狹縫寬度5.0 nm。

2 結果

2.1 重組藻膽蛋白和類囊體的提取

重組表達后的藻紅蛋白、藻藍蛋白、BL21蛋白用Nanodrop 2000測得的蛋白質濃度分別為：重組藻紅蛋白88.27 mg/mL，重組藻藍蛋白92.23 mg/mL，空表達菌株E.coliBL21蛋白濃度為71.15 mg/mL，用PBS將三種蛋白溶液稀釋至相同濃度50 mg/mL。

提取的類囊體溶液濃度分別為：菠菜：0.98 mg/L，韭菜：2.09 mg/L。

2.2 重組藻膽蛋白與類囊體膜混合孵育吸收光譜檢測結果

2.2.1 時間梯度對吸收光譜的影響 以孵育時間為橫坐標，以吸收光譜峰面積為縱坐標，得到圖1。從圖中可以看出，隨孵育時間的增加，混合溶液的吸光光譜峰面積呈先增加后略下降的趨勢。

根據圖1A，藻紅蛋白和藻藍蛋白的混合溶液與菠菜類囊體溶液混合后，孵育至15 min吸收峰面積達最大值；而重組藻紅蛋白、重組藻藍蛋白分別與菠菜類囊體的混合溶液在孵育到10 min時吸收峰面積達最大值。因為藻膽蛋白與類囊體膜結合才能進行光能傳遞，混合孵育10～15 min可能有利于藻膽蛋白與類囊體膜比較好的結合，從而有利于能量的吸收和傳遞，故將15 min作為檢測吸收光譜時藻紅和藻藍蛋白混合溶液與類囊體的最適孵育時間，將10 min作為檢測吸收光譜時重組藻紅蛋白、重組藻藍蛋白分別與類囊體混合孵育的最適時間。

同樣，在韭菜類囊體溶液與藻紅、藻藍蛋白混合的結果中，由圖 1B得出，10 min可以作為檢測吸收光譜時重組藻藍蛋白以及重組藻紅和藻藍蛋白混合溶液與韭菜類囊體混合的最適孵育時間，20 min可以作為檢測吸收光譜時重組藻紅蛋白與韭菜類囊體混合孵育的最適時間。

(PE: 藻紅蛋白Phycoerythrin; PC: 藻藍蛋白Phycocyanin. A: 菠菜類囊體與重組藻膽蛋白混合孵育；B: 韭菜類囊體與重組藻膽蛋白混合孵育。A: Thylakoid of Spinacia oleracea; B: Thylakoid of Allium tuberosum.)

2.2.2 濃度梯度對吸收光譜的影響 以重組藻膽蛋白的添加量作為橫坐標，以吸收光譜峰面積作為縱坐標，重組藻膽蛋白濃度的增加對光能吸收的影響變化如圖2所示。

從圖2中可以看出，與添加藻膽蛋白的組相比，添加PBS的菠菜類囊體溶液、韭菜類囊體溶液的吸收光譜峰面積值最低，而且隨著PBS溶液的加入，吸收光譜峰面積值進一步降低。當加入藻膽蛋白后，混合溶液的吸收光譜峰面積總體呈上升趨勢，而且高于對應濃度下藻膽蛋白與類囊體溶液吸收光譜值的加和，差異顯著(A：P<0.01，B：P<0.05)。這說明重組藻膽蛋白可以提高菠菜類囊體、韭菜類囊體的吸收光譜峰面積，這種提高并不只是二者光譜的簡單疊加，而是可能來自藻膽蛋白與類囊體膜的相互作用，重組藻膽蛋白的加入可以增強菠菜類囊體、韭菜類囊體的光吸收。

分別與菠菜類囊體、韭菜類囊體混合孵育的體系之間的相互比較可以看出重組藻紅和藻藍蛋白的混合溶液的吸收光譜峰面積處于最高的水平，這說明重組藻紅蛋白和藻藍蛋白的混合溶液對于增強菠菜類囊體、韭菜類囊體的光吸收的作用是最明顯的。

(PE: 藻紅蛋白Phycoerythrin; PC: 藻藍蛋白Phycocyanin; Thylakoid: 類囊體. A: 菠菜類囊體與重組藻膽蛋白混合孵育；B: 韭菜類囊體與重組藻膽蛋白混合孵育。A: Thylakoid of Spinacia oleracea; B: Thylakoid of Allium tuberosum.)

2.2.3 藻紅蛋白與藻藍蛋白濃度比例對吸收光譜的影響 吸收光譜檢測結果如圖3所示。以550、620和663 nm(分別為藻紅蛋白、藻藍蛋白、葉綠素a的特征吸收峰值處的波長)作為橫坐標，以對應的吸光度作為縱坐標，得到圖3A、圖3C。圖A、C表明重組藻膽蛋白的加入可能與類囊體膜有相互作用從而使各吸收峰處的光吸收值得到提高。藻紅∶藻藍為1∶2時對吸光度的影響略大，差異不顯著(P>0.05)。

(PE: 藻紅蛋白Phycoerythrin; PC: 藻藍蛋白Phycocyanin. A、C: 特征吸收峰的吸光度值；B、D: 為吸光光譜峰面積；A、B: 菠菜類囊體與重組藻膽蛋白混合孵育；C、D: 韭菜類囊體與重組藻膽蛋白混合孵育。A/C: Absorbance value of the characteristic absorption peak; B/D: Absorbance peak area; A/B: Thylakoid of Spinacia oleracea; Fig. C/D: Thylakoid of Allium tuberosum.)

以藻紅和藻藍蛋白的濃度比例作為橫坐標，以吸收光譜峰面積作為縱坐標得到圖3B、D。從圖3B、D可以看出在提高菠菜、韭菜類囊體光吸收方面當藻紅∶藻藍為1∶2時對于提高類囊體的光吸收作用最顯著(P<0.05)。

2.3 重組藻膽蛋白與類囊體膜混合孵育的熒光光譜檢測

2.3.1 時間梯度對熒光光譜的影響 以混合孵育時間為橫坐標，以葉綠素a特征熒光發射峰680 nm處的峰值為縱坐標，熒光檢測結果如圖4所示，隨孵育時間的增加藻膽蛋白傳遞給菠菜類囊體的光能增加。

菠菜類囊體同重組藻紅和藻藍蛋白的混合溶液、重組藻紅蛋白溶液在孵育20 min后熒光值有所下降，而重組藻藍蛋白在孵育15 min后熒光值有所下降(見圖4A)。所以將20 min作為重組藻紅和藻藍蛋白混合溶液、重組藻紅蛋白溶液與菠菜類囊體混合后進行熒光檢測的最適孵育時間，將15 min作為重組藻藍蛋白與菠菜類囊體混合溶液進行熒光檢測的最適孵育時間。

重組藻藍蛋白溶液、重組藻紅蛋白、重組藻紅和藻藍蛋白混合溶液與韭菜類囊體混合后，熒光值隨孵育一定時間的增加而增加，在孵育至20 min后熒光值有所下降，而重組藻紅蛋白在孵育25 min后熒光值有所下降(見圖4B)，所以將20 min作為重組藻藍蛋白溶液、重組藻紅和藻藍蛋白混合溶液與韭菜類囊體混合后進行熒光檢測的最適孵育時間，將25 min作為重組藻紅蛋白與韭菜類囊體混合溶液進行熒光檢測的最適孵育時間。

(PE: 藻紅蛋白Phycoerythrin; PC: 藻藍蛋白Phycocyanin. 激發波長為430 nm 。A: 菠菜類囊體與重組藻膽蛋白混合孵育；B: 韭菜類囊體與重組藻膽蛋白混合孵育。Fluorescence emission at 430 nm. A: Thylakoid of Spinacia oleracea; B: Thylakoid of Allium tuberosum.)

2.3.2 濃度梯度對熒光光譜的影響 以藻膽蛋白添加量為橫坐標，以葉綠素a熒光特征發射峰680 nm下的熒光峰值為縱坐標，重組藻膽蛋白對類囊體熒光強度的影響變化如圖5所示。

圖5A、D為在葉綠素a的特征熒光激發波長430 nm的激發下，得到的葉綠素a特征熒光發射峰680 nm處的熒光強度。從圖中可以看出類囊體溶液中添加PBS對其熒光峰值沒有顯著的影響；添加空白大腸桿菌E.coliBL21的細胞破碎液對熒光峰值也有的提高作用，但不如藻膽蛋白顯著；當加入重組藻膽蛋白時，其葉綠素a的熒光特征峰峰值呈上升趨勢，表明熒光峰值的提高是重組藻膽蛋白的加入引起的。其中添加重組藻藍蛋白組的熒光峰值顯著高于相同濃度的藻藍蛋白的熒光峰值與類囊體熒光峰值的加和(圖5A:P<0.05, 圖5D:P<0.01)，說明重組藻藍蛋白受激發后發射的熒光可以進一步激發類囊體膜上的葉綠素a，從而使熒光值進一步提高。但是添加重組藻紅蛋白組，熒光峰值與相同濃度的藻紅蛋白的熒光峰值和類囊體熒光峰值的加和差異不顯著(P>0.05)，表明加入藻紅蛋白后熒光峰值的提高可能是熒光峰值的疊加，而不是光能傳遞引起的。另外通過對與菠菜類囊體混合孵育的不同重組藻膽蛋白的曲線的對比，可以發現重組藻紅和藻藍蛋白的混合溶液對熒光峰值的提高作用最強(P<0.01)，差異極顯著，表明在重組藻紅和藻藍蛋白同時存在時，會有光能的逐級激發和傳遞，從而使得熒光峰顯著提升。

圖5B、E為在重組藻紅蛋白的熒光特征峰的激發波長420 nm的激發下，得到的在葉綠素a特征熒光峰680 nm處的熒光強度。從圖中可以觀察到，隨著重組藻紅和藻藍蛋白混合溶液的加入，類囊體溶液的葉綠素a熒光特征峰值處的熒光強度在不斷升高；與藻紅和藻藍蛋白混合溶液的熒光強度與類囊體熒光強度加和相比，有顯著提升(P<0.05)，但是若只添加藻紅蛋白到類囊體的混合溶液的熒光發射峰值，與相同濃度下藻紅蛋白的熒光峰值和類囊體熒光峰值的加和基本相當，差異不顯著(P>0.05)。說明420 nm的光可以激發藻紅蛋白，藻紅蛋白的熒光發射光能進一步激發藻藍蛋白，藻藍蛋白受激發后的光能可以再激發葉綠素a，從而使得熒光峰顯著提升；但是若體系中缺乏藻藍蛋白，受激發的藻紅蛋白發射的熒光并不能傳遞給葉綠素a，而只是與葉綠素a的熒光發射峰值疊加。因此表明單獨的藻紅蛋白并不能將光能傳遞給類囊體膜上的葉綠素a，而體系中添加藻藍蛋白后才可以。

(PE: 藻紅蛋白Phycoerythrin; PC: 藻藍蛋白Phycocyanin; Thylakoid: 類囊體. A、B、C: 菠菜類囊體；D、E、F: 韭菜類囊體；A、D: 激發波長430 nm; B、E: 激發波長420 nm; C、F: 激發波長580 nm. A/B/C: Thylakoid of Spinacia oleracea; D/E/F: Thylakoid of Allium tuberosum A/D: Fluorescence emission at 430 nm; B/E: Fluorescence emission at 420 nm; C/F: Fluorescence emission at 580 nm.)

圖5C、F為在藻藍蛋白的熒光特征峰的激發波長580 nm的激發下，得到的在葉綠素a特征熒光峰處的熒光強度。從圖中可以看出與葉綠素a混合孵育的重組藻藍蛋白溶液測得的熒光強度遠大于未與類囊體混合孵育的藻藍蛋白，而且顯著高于相同濃度的藻藍蛋白的熒光峰值與類囊體熒光峰值的加和(C∶P<0.01, F∶P<0.05)，這說明重組藻藍蛋白受到580 nm光激發后，除了自身在680 nm發射一定的熒光，引起熒光值提升外，重組藻藍蛋白也可以將光能傳遞給類囊體膜，從而引起葉綠素a熒光強度的顯著提升。

2.3.3 藻紅蛋白與藻藍蛋白濃度比例對熒光光譜的影響 以420、580、430 nm(分別為重組藻紅蛋白、重組藻藍蛋白、葉綠素a的特征熒光峰值處的激發波長)作為橫坐標，以對應的熒光特征發射峰680 nm處的熒光強度作為縱坐標，熒光檢測結果如圖6所示。從圖可以看出不管是菠菜類囊體還是韭菜類囊體，都表現出在藻藍蛋白特征激發波長580 nm激發條件下，藻紅∶藻藍為1∶2時對于熒光強度的提升最大，差異極顯著(P<0.01)。但在藻紅蛋白和葉綠素a的特征激發波長下(分別為420和430 nm)，藻紅∶藻藍為1∶2時對于熒光強度的提升較大，但是差異并不顯著。

3 討論

在藍藻和紅藻中，藻膽體與類囊體膜相連，將捕獲的光能以接近100%的效率傳遞到類囊體進行光合作用。藻膽體能夠捕捉高等植物無法捕捉的540～650 nm區域內的可見光，若利用藻膽蛋白來拓寬高等植物的吸收光譜，將有可能捕獲更多的光能促進植物的光合作用。為此藻膽蛋白與高等植物類囊體膜間能否有效進行光能傳遞成為這一設想得以實現的前提。

人們依據藻膽體內部及其與自身類囊體膜之間的能量傳遞機制，探索了天然藻膽蛋白或藻膽體與高等植物類囊體膜之間的能量傳遞情況。容壽榆等[6]通過測定藻膽體與菠菜光系統Ⅱ的混合溶液的光譜以及溶液的放氧活性，得到的結果表明它們可以進行能量傳遞。李文軍等[11]的研究結果證實,與天然別藻藍蛋白三聚體相比較,基因重組別藻藍蛋白三聚體有正確的能量傳遞功能。為了驗證重組藻膽蛋白是否也具有與類囊體膜光能傳遞的作用，本文純化了具有光學活性的重組藻紅蛋白和重組藻藍蛋白，分別與高等植物菠菜和韭菜類囊體混合孵育，研究他們的光能傳遞規律，為在高等植物中建立新型的光合系統提供理論基礎。

(PE: 藻紅蛋白Phycoerythrin; PC: 藻藍蛋白Phycocyanin. A: 菠菜類囊體；B: 韭菜類囊體。A: Thylakoid of Spinacia oleracea; B: Thylakoid of Allium tuberosum.)

本文將重組藻紅蛋白、重組藻藍蛋白分別與菠菜、韭菜類囊體溶液進行混合孵育。設計了時間梯度，確定了本研究的最適孵育時間，然后檢測混合溶液的吸收光譜和熒光光譜。通過對結果的分析可以發現，在加入重組藻膽蛋白后，類囊體溶液的特征熒光峰值和吸收光譜峰面積都有所提高，而且隨著重組藻膽蛋白濃度的增加峰值隨之升高，這與仵小南等[4]通過實驗證明藻膽蛋白與菠菜類囊體混育后，可以將吸收的光能傳遞給菠菜的光系統I的結果一致。其中對于吸收光譜，與菠菜類囊體(或韭菜類囊體)膜溶液混合體系的吸收光譜峰面積顯著高于對應濃度下藻膽蛋白與類囊體溶液吸收光譜值的加和(P<0.01)。說明重組藻膽蛋白與天然藻膽蛋白一樣可以提高植物類囊體的光吸收能力。這種提高并不只是二者光譜的簡單疊加，而且可能來自藻膽蛋白與類囊體膜的相互作用。在對熒光光譜的檢測結果中，我們發現在420、430、580 nm的光激發下，重組藻藍蛋白都能將光能傳遞給類囊體中的葉綠素a，使得葉綠素a的熒光發射峰值顯著提升。重組藻紅蛋白與天然藻紅蛋白一樣，不能與菠菜或韭菜的類囊體膜發生光能傳遞，但是當體系中添加重組藻藍蛋白的時候就可以，而且當藻紅蛋白和藻藍蛋白的比例是1∶2時，光能傳遞效率最高。

由于天然藻紅蛋白的結構為α、β和γ三個亞基以單聚體或多聚體的形式存在，而在本研究中，重組菌株只含有藻紅蛋白的α和β亞基，不能形成多聚體，另外藻紅蛋白的重組菌株不含有色基裂合酶，不能催化脫輔基藻紅蛋白和藻紅膽素結合形成正確構象，這些原因可能造成了重組藻紅蛋白與天然藻紅蛋白熒光發射的差異[12]。

農作物生產是人類生存的基礎，農作物栽培中由于密集種植、葉片遮擋帶來的光能不足直接影響其生長率的提高，因此提高光能吸收率，加快農作物生長率成為我們要研究的首要問題。本文選用了一種單子葉植物、一種雙子葉植物，其中菠菜屬于被子植物門、雙子葉植物綱。韭菜屬于種子植物門、被子植物亞門、單子葉植物綱。通過對結果的分析可以發現菠菜類囊體溶液和韭菜類囊體溶液與重組藻膽蛋白混合孵育后的檢測結果有細微的不同，但大致上的結果都是相同的，都可以接收到重組藻膽蛋白傳遞的光能，并被提高了光吸收能力，表明重組藻膽蛋白可以與高等植物類囊體膜進行能量傳遞，這為構建新型的光合系統，提高高等植物的光吸收范圍，進而提高產量提供了可能。