腦原位缺血預處理通過Nrf2/HO-1信號通路減輕大鼠缺血再灌注損傷

王歡歡 王剛 仲婷婷 孫健 賀宏梅 寇文輝 宋愛霞 鄒玉安 薛茜

(河北北方學院附屬第一醫院神經內科，河北 張家口 075000)

急性缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，占我國腦卒中的69.6%～70.8%〔1，2〕，已嚴重危害當今社會中老年人的健康和生命，每年約有數百萬人新發腦卒中。目前急性腦梗死的特異性治療包括改善腦血循環(靜脈溶栓、血管內治療、抗血小板、抗凝、降纖、擴容等方法)、他汀及神經保護等〔3〕。其中靜脈溶栓現認為有效搶救半暗帶組織的時間窗為4.5 h內或6 h內〔3〕，隨著DAWN或DEFUSE-3研究急性前循環大血管閉塞的時間窗被擴展到16或24 h〔4〕，但由于嚴格的適應證和短暫的時間窗限制，以上治療僅適用于少數患者。因此還需要進一步了解缺血病理過程的復雜機制來開發缺血性疾病的內源性保護機制。以往研究證實，腦缺血再灌注損傷的發病機理有若干因素包括：(1)興奮性氨基酸毒性作用；(2)Ca2+超載；(3)線粒體損傷；(4)氧化應激；(5)炎癥損傷；(6)細胞凋亡等，而氧化應激損傷是腦缺血再灌注損傷的核心病理環節。目前，急性缺血性腦血管病內源性保護機制的研究受到廣泛關注，通過給予組織一個低于損傷劑量的刺激如缺血、低氧等，激活機體自身的內源性保護機制，已達到減輕嚴重損傷所帶來的傷害〔5〕。這種機制主要包括缺血預處理和后處理，而缺血預處理又包括原位缺血預處理和遠隔器官缺血預處理。以往研究表明，眾多的神經遞質、蛋白及信號通路可能參與腦缺血預處理的過程，但其作用機制尚未完全明確〔6〕。而核因子E2相關因子(Nrf)2/血紅素加氧酶(HO)-1信號通路是內源性抗氧化應激的關鍵調控因子之一〔7〕。本研究旨在探討腦原位缺血預處理是否可通過調控Nrf2/HO-1信號通路，提高缺血打擊的耐受能力。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 250～280 g雄性SD大鼠180只，由河北北方學院實驗動物中心提供，并獲得河北北方學院動物實驗管理委員會批準。實驗動物中心室溫(24±1)℃、相對濕度(45±5)%、日光燈照射12 h明暗交替。將180只雄性SD大鼠編號并按隨機數字表法分為假手術組(sham組)、 缺血再灌注組(model組)、缺血預處理組(CIPC組)，每組又分別分為術后6、12、24、48和72 h。

1.2模型制作及評價 采用Zea-Longa大腦中動脈線栓法建立大鼠模型〔8〕。大鼠水合氯醛腹腔注射全麻后，分離頸總、頸內、頸外動脈，結扎頸外動脈及頸總動脈近心端，從頸總動脈遠心端將線栓送至頸內動脈(18±2)mm，2 h后抽出線栓造成再灌注損傷。CIPC組行右側頸內動脈短暫性血流阻斷10 min，3 d后，同model組方法建立模型，sham組暴露并結扎血管，不插入線栓。動物清醒后，參照longa 5級評分法篩選動物模型，選取1～3分的動物為造模成功。

1.3主要試劑 MCAO栓線(北京西濃科技有限公司)；兔抗Nrf2多克隆抗體(美國Santa Craz)；兔IgG兩步法免疫組織化學檢測試劑盒(博士德生物)；RNAiso Plus(寶生物工程有限公司)；Fast Quant RT Kit(with gDNase，天根生化科技有限公司)；Super Real PreMix Plus(SYBR Green，天根生化科技有限公司) 。

1.4方法

1.4.1神經功能評分 實驗大鼠在術后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h進行改良Garcia J H評分，包括：自主運動、體態、前肢伸展運動、抓持和攀爬鐵籠能力、兩側身體觸覺反射和兩側胡須觸碰反應6部分內容，功能正常時得分最高，18分。

1.4.2蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組化檢測Nrf2 將腦組織制成5 μm厚的組織切片分別進行HE染色和免疫組化，光學顯微鏡下進行觀察。

1.4.3qRT-PCR 方法檢測Nrf2和HO-1 mRNA的表達量 麻醉大鼠，生理鹽水進行心臟灌注，取缺血側腦組織，在液氮中研磨充分后，按Trizol 試劑說明書提取總RNA，紫外分光光度計檢驗RNA 純度，要求波長在260 nm和280 nm處吸光度比值為1.8～2.0。用 RT 逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，建立qPCR體系20 μl，反應條件為：95℃預變性15 min，95℃變性10 s，退火60℃15 s，40個循環。以β-actin為內參照，Nrf2 上游引物：5＇-CACATCCAGACAGACACCAGT-3＇，下游引物：5＇-CTACAAATGGGAATGTCTCTGC-3＇；HO-1上游引物5＇-GAACTGTGGTCGGTAGAGGC-3＇，下游引物5＇-ATCAAAGTGGCCATGACGCT-3＇；β-actin上游引物5＇-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3＇，下游引物5＇-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3＇。

設置熔解曲線判斷是否有非特異性的擴增。校正每個樣品的Ct值，得ΔCt值。以2-ΔΔCt法計算各組間mRNA的表達量。ΔΔCt=各組(Ct目的基因-Ct β-actin)-對照組(Ct目的基因-Ct β-actin)，2-ΔΔCt=各組基因表達量/假手術組基因表達量〔9〕。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠不同缺血再灌注時間改良Garcia J H評分比較 model組和CIPC組在各個時間點的神經缺損評分均明顯低于sham組(均P<0.01)。再灌注24 h、48 h和72 h時CIPC組的神經缺損評分明顯高于model組(均P<0.05)，見表1。

2.2大鼠HE染色 sham組大鼠神經細胞大而圓，形態規則，連接緊密。model組6 h出現細胞水腫，細胞周圍間隙增寬，細胞間隙出現大小不等的空泡，無明顯細胞壞死；12 h時細胞明顯水腫、上述癥狀逐漸加重；24、48 h時神經元核固縮、濃染，神經元結構明顯破裂、排列紊亂，細胞核呈深染、固縮，周圍出現較大空泡，細胞壞死明顯；72 h時神經元水腫逐漸減輕，部分細胞出現不可逆性壞死。CIPC組各時間點較缺血再灌注組均可見神經細胞缺血性改變減輕。見圖1。

表1 各組大鼠不同缺血再灌注時間改良Garcia J H評分比較分，n=6)

圖1 各組大鼠腦梗死神經元形態變化(HE，×400)

2.3各組大鼠 Nrf2表達情況 sham組Nrf2表達無明顯改變，在6 h時model組及CIPC組Nrf2核著色的陽性細胞開始增多，24 h達高峰，48 h開始下降。model組與CIPC組在各時間點Nrf2核陽性細胞數明顯高于sham組(P<0.01)。CIPC組在各個時間點Nrf2核陽性細胞數明顯高于model組(P<0.05，P<0.01)，見表2、圖2。

表2 各組大鼠不同缺血再灌注時間Nrf2表達情況比較個，n=6)

2.4各組大鼠Nrf2和HO-1 mRNA表達情況 sham組Nrf2、HO-1呈低水平表達且隨著時間的延長無明顯變化。model組、CIPC組Nrf2、HO-1 mRNA在缺血6 h時表達開始增加，24 h時達到高峰，48 h開始下降；model組與CIPC組在各時間點Nrf2、HO-1mRNA的表達均明顯高于sham組(P<0.05，P<0.01)。CIPC組在各個時間點Nrf2、HO-1 mRNA的表達均明顯高于model組(P<0.05，P<0.01)。見表3。

圖2 各組大鼠免疫組織化學染色(DAB，×400)

表3 各組大鼠不同缺血再灌注時間Nrf2和HO-1 mRNA表達比較

3 討 論

缺血性腦卒中是由于腦血管阻塞導致血流供應障礙引起的腦卒中，腦細胞由于能量供應障礙引發了瀑布式級聯反應導致腦細胞損傷〔10，11〕。目前關于腦缺血神經保護劑的研究眾多，但結果尚存爭議。其主要原因在于目前研究主要針對單一靶點的藥物，這與缺血性腦損傷瀑布式級聯反應過程是相悖的。因此努力探究全面的神經保護治療方案至關重要。Correia等〔11〕研究發現冠狀動脈缺血預處理可引起再發心肌梗死，但其體積減小75%。由此揭示了缺血再灌注損傷的內源性保護機制，并率先提出缺血預處理(IPC)的概念。最開始，大多數學者對IPC研究的重點在如何增強心肌對缺血的抵抗力方面，后期大部分的實驗證明IPC所帶來的缺血耐受是一種較普遍的現象，可在各個器官中發生，包括心臟、大腦、腎臟、視網膜等〔12〕。心肌和腦組織是相對缺血較敏感的組織，因此也是開展IPC最有希望的部位。以往研究證實，眾多的神經遞質、蛋白和信號通路可能參與IPC的保護作用〔13，14〕。在臨床工作中，我們發現有TIA病史的患者腦卒中發病率及卒中嚴重程度都有所下降，這一現象為研究腦缺血預處理提供了思路。

既往研究表明，Nrf2/HO-1信號通路具有抗氧化應激損傷的重要作用〔15〕。靜息狀態下，Nrf2與其抑制因子 Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白(Keap)1在細胞質中耦聯，處于相對抑制的狀態〔16～20〕，當細胞缺血缺氧時，Nrf2與Keap1解離，Nrf2核轉位并結合HO-1。 HO-1在細胞應激過程中發揮抗氧化、抗炎的作用。此外，研究證實HO-1還可作為細胞應激的保護性應答標志〔18，19～22〕。Tanaka等〔23〕發現，在腦缺血再灌注模型中，Nrf2的表達是一個動態變化的過程，Nrf2在缺血組織中2 h時表達量上升，8 h時達到高峰，24 h和72 h時表達下降。而在本研究中，腦缺血預處理也顯著增加了Nrf2核轉移陽性細胞的數量及Nrf2 mRNA的表達，也呈現一動態變化過程，這與上述研究是一致的。

本研究結果推測CIPC通過Nrf2/HO-1信號通路對缺血再灌注損傷發揮神經保護作用。本研究結果為缺血缺氧性腦病防治提供了新的治療策略，有望改善病人預后。