黃芪甲苷對阿霉素誘導心力衰竭大鼠模型心室重構及心肌能量代謝的影響

張夢 全毅紅 郭明星 甘盼盼 劉暢 黃芳

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院，湖北 武漢 430050)

據流行病學調查結果顯示，歐洲老年心力衰竭患病率達6%～10%，5年存活率較低，且近年發病率呈不斷上升趨勢，不利于患者預后〔1〕。心力衰竭發病機制復雜，一項動物模型研究顯示，心室重構是心力衰竭發展的重要環節，心肌細胞線粒體代謝障礙可導致心肌細胞凋亡，而心肌細胞凋亡是心室重構重要病理基礎，可促進心力衰竭發展〔2，3〕。因此，保護心力衰竭患者線粒體結構及功能，抑制心肌細胞凋亡成為臨床防治心力衰竭新靶點。目前，臨床治療心力衰竭患者常通過強心、利尿等對癥支持治療，雖可在一定程度上緩解患者癥狀，但整體效果不佳，輔以抗心肌細胞凋亡，預防心室重構等方式可提高治療效果〔4～6〕。黃芪甲苷具有抗炎、改善心血管疾病等作用，還可調節內皮細胞功能，對心肌細胞具有一定保護作用，但具體機制尚未明確〔7〕。本研究通過阿霉素建立心力衰竭大鼠模型，并使用曲美他嗪、黃芪甲苷治療，主要觀察黃芪甲苷對大鼠心室重構及心肌能量代謝的影響，旨在指導未來心力衰竭的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1實驗動物 成年雄性SD大鼠40只，均購自山東大學醫學院動物實驗中心，大鼠均為清潔級，6～9周齡，平均(7.11±1.01)w；體重0.16～0.24 kg，平均(0.20±0.03)kg。飼養均在標準環境下，每12 h晝夜交替1次，保證大鼠得到充足的飲水及食物。

1.2方法

1.2.1主要藥品與試劑 注射用鹽酸阿霉素由山西普德藥業有限公司提供，國藥準字H14023879，規格：10 mg/瓶；黃芪甲苷由南京春秋生物工程有限公司提供，純度為98%；鹽酸曲美他嗪由南京正科醫藥股份有限公司提供，國藥準字H20083803，規格20 mg/片；0.9%氯化鈉注射液由成都科倫藥業股份有限公司，國藥準字H20181161，規格100 ml/瓶；原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)凋亡試劑盒、酶聯免疫吸附試劑、免疫層分析法試劑盒均購自萬類生物公司；北京樂普科技有限責任公司提供的LEPU Quant-Gold免疫定量分析儀。

1.2.2主要儀器與設備 加拿大VisualSonics公司提供的Vevo2100超高分辨率小動物超聲成像系統；日本尼康公司提供的TE2000-s倒置熒光顯微鏡；廣州威佳公司提供的JW-3021HR型高速臺式離心機；德國萊卡公司提供的切片架；北京正開儀器有限公司提供的電子秤及低溫冰箱；常州中威電子儀器廠提供的包埋機、石蠟切片機、組織漂烘儀。

1.2.3大鼠分組及處理

1.2.3.1分組 選取雄性SD大鼠40只，進行常規適應性飼養7 d后，隨機選擇其中10只大鼠作為空白對照組，另將30只大鼠通過阿霉素誘導建立心力衰竭模型，建模成功后隨機分為3組，每組各10只，分別設為模型組、曲美他嗪組、黃芪甲苷組。

1.2.3.2建立心力衰竭大鼠模型 除空白對照組外，其余動物以3 mg/kg劑量阿霉素溶液腹腔注射；空白對照組給予等體積0.9氯化鈉溶液注射，1次/w，共8 w，累積劑量為24 mg/kg，建立心力衰竭大鼠模型。造模結束后2 w頸總動脈插管測動物心功能，取心臟組織常規蘇木素-伊紅染色，進行病理組織檢查；病理檢查心肌呈心力衰竭樣病變為建模成功。建模成功后，曲美他嗪組給予鹽酸曲美他嗪10 mg/kg灌胃、黃芪甲苷組給予黃芪甲苷60 mg/kg灌胃，1次/d；連續給藥8 w，剩余兩組均給予同體積純凈水。

1.3相關指標檢測

1.3.1心室重構指標檢測法 干預結束后，稱量大鼠體重并記錄，固定大鼠，采用超高分辨率小動物超聲成像系統測定各組大鼠左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)、左室射血分數(LVEF)等心室重構指標。

1.3.2心肌細胞凋亡檢測法 切片常規脫蠟、水化后，根據TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書中實驗步驟進行染色操作，于熒光顯微鏡下觀察大鼠心肌細胞凋亡狀況。每張切片選擇5個視野(×400)，計算陽性細胞數，細胞凋亡指數(AI)=陽性細胞數/總細胞×100%，計算每個視野內AI并取平均值。

1.3.3心肌能量代謝指標檢測法 干預結束后，取材前一天停止大鼠食物供給，可正常飲水，標本取材過程中，先用10%水合氯醛溶液，以0.3 ml/100 g劑量對大鼠進行腹腔注射，徹底麻醉后開胸暴露心臟，使用一次性真空采血管針經心尖部采集血液5 ml；收集血液置于恒溫箱中靜置30 min，2 000 r/min離心15 min，取出管內上清液，置于-80℃冰箱中待檢。采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清N末端B型腦鈉肽前體(NT-proBNP)水平；采用免疫層分析法檢測血清心肌肌鈣蛋白(CTn)I水平。

1.4統計學方法 應用SPSS20.0統計學軟件進行Shapiro-Wilk正態性檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.14組大鼠心室重構指標比較 與空白對照組比較，其他3組LVEDD、LVESD顯著升高，LVEF顯著下降(P<0.05)；黃芪甲苷組、曲美他嗪組LVEDD、LVESD低于模型組，LVEF高于模型組(P<0.05)，且黃芪甲苷組LVEDD、LVESD低于曲美他嗪組，LVEF高于曲美他嗪組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組心室重構指標比較

2.24組大鼠心肌細胞AI比較 空白對照組心肌細胞AI為(1.76±0.26)%；模型組心肌細胞AI為(20.16±2.36)%；曲美他嗪組心肌細胞AI為(8.69±1.10)%；黃芪甲苷組心肌細胞AI為(4.72±1.03)%。與空白對照組比較，其他3組大鼠心肌細胞AI顯著明顯升高(P<0.05)；黃芪甲苷組、曲美他嗪組心肌細胞AI顯著低于模型組(P<0.05)，且黃芪甲苷組心肌細胞AI顯著低于曲美他嗪組(P<0.05)。

2.34組心肌能量代謝比較 與空白對照組比較，其他3組NT-proBNP、CTnI顯著升高(P<0.05)；黃芪甲苷組、曲美他嗪組NT-proBNP、CTnI水平顯著低于模型組(P<0.05)，且黃芪甲苷組NT-proBNP、CTnI水平顯著低于曲美他嗪組(P<0.05)。見表2。

表2 4組心肌能量代謝比較

3 討 論

傳統醫學認為心力衰竭與心腎陽氣虧虛關系密切，而氣虛與機體細胞能量荷值有關，心肌能量代謝障礙是心氣虛的原因之一，故治療心力衰竭應以補益心腎陽氣為主，對改善心肌能量代謝具有重要作用〔8〕。黃芪甲苷是一種從黃芪中提取的高純度藥物，近年逐漸被臨床應用心血管疾病治療中，可維持心肌細胞內鈣穩態，具有抗細胞凋亡、改善心肌能量代謝等作用〔9,10〕。動物模型研究顯示，黃芪甲苷不僅具有保護肝臟、抗炎、鎮痛等功效，還可加強機體心臟收縮力，保護心肌，起到抗心力衰竭等作用〔11〕。

心力衰竭因血流動力學負荷較重，加之炎癥刺激可引起心肌結構及功能發生變化，隨著心室重構不斷發展，心肌損傷及心功能進一步惡化，進而出現心肌凋亡，心肌細胞凋亡的出現提示心力衰竭從代償發展為失代償〔12〕。本研究提示黃芪甲苷抑制心力衰竭心肌細胞凋亡作用更好，分析其原因可能與黃芪甲苷抗細胞凋亡機制有關。心室重構是心力衰竭的主要病理基礎，故防治心室重構成為臨床治療心力衰竭新靶點。LVEF是左心室收縮功能量化的重要指標，是左心室單位容積內射血量，不僅可反映左心室射血效率，還是心室重構重要指標；LVEDD、LVESD也是臨床常用的心室重構評估指標〔13〕。本研究結果提示黃芪甲苷用于心力衰竭的治療，可在一定程度上預防心室重構。分析其原因可能為，黃芪甲苷中黃芪具有抗炎、調節免疫功能、抗細胞凋亡作用，而細胞凋亡是導致心室重構主要原因，故黃芪甲苷具有防治心室重構作用〔14〕。

心肌能量代謝異常在心力衰竭發生及發展過程中起到重要作用。NT-proBNP是腦尿納肽的氮末端產物，具有利尿、擴血管等作用，參與心室重構整個過程，目前被臨床廣泛應用于心力衰竭診斷中〔15〕。研究顯示，NT-proBNP水平升高與心功能損傷具有一定關系，其水平越高提示心肌受損程度越重，心肌能量代謝越差〔16〕。CTnI是一種理想的心肌細胞特異性標志物，也是目前臨床診斷心肌損傷的重要指標之一，在心肌收縮及舒張中起到重要作用，對評估心肌能量代謝具有一定作用〔17〕。本研究結果提示黃芪甲苷可改善心力衰竭大鼠心肌能量代謝。陳彥等〔18〕研究顯示，黃芪甲苷可通過調節心肌細胞能量代謝治療心力衰竭患者，效果較好。該結果證實的藥物的改善心肌能量代謝效果與本研究一致，進一步說明黃芪甲苷在心力衰竭中的應用價值之高。但因黃芪甲苷具體作用機制尚未明確，且臨床實際中相關研究較少，故本研究結果真實性、可靠性及其是否對臨床具有指導意義均需在未來展開較多的動物試驗或臨床研究加以驗證。

綜上所述，經阿霉素誘導的心力衰竭大鼠在經黃芪甲苷治療后，心肌細胞凋亡抑制效果好，在防治心室重構方面意義重大，大鼠心肌能量代謝改善明顯，應用價值高。