基于蛋白質組學技術研究8 w中等強度低負荷量運動對增齡大鼠肝臟蛋白質組的影響

蘇醒 蘇巍

(1淮安信息職業技術學院基礎部，江蘇 濰安 223003；2上海交通職業技術學院)

衰老機體內環境生物學特性改變，引起結構變化和功能失調及相關疾病的發生〔1〕。肝臟是體內最大實質器官，約占人體總重量的2%，具有儲存、分泌、解毒等代謝功能。肝臟是個體衰老過程中最易受累的器官之一。研究表明相對于年輕個體，老年個體更容易罹患肝臟疾病，如肝炎、非酒精性脂肪肝、肝臟纖維化等〔1，2〕。系列文獻報道，增齡性大鼠的肝臟組織伴有過度的氧化應激〔3〕、纖維化〔4〕、炎癥反應〔5〕、肝細胞再生能力下降〔6〕、糖脂代謝失調〔7〕、肝細胞線粒體生物更新和自噬能力下降〔7〕、肝細胞凋亡〔8〕等過程，這些增齡性功能改變將顯著增加肝臟的胰島素抵抗、脂肪肝病變、肝纖維化和肝癌的風險。因此，探究肝臟的抗衰老機制對于揭示預防衰老相關的肝臟病變的藥物靶點、開發有效的干預手段具有重要的理論和現實意義。

體育運動對包括肝臟在內的多種組織具有系統性的抗衰老效應〔9〕。研究表明，中等強度的有氧運動能提高增齡大鼠肝臟的抗氧化酶活性〔10，11〕，提高老齡大鼠肝臟線粒體氧化磷酸化〔12〕和能量代謝水平〔13〕及胰島素的敏感性〔14〕，抑制炎癥因子表達和纖維化程度〔15〕。研究發現，中等強度耐力運動能經G蛋白調控增齡大鼠肝細胞胰高血糖素(glucagon)受體介導的信號通路、核轉錄因子-κB介導的氧化還原信號和胰島素受體底物(IRS)-1介導的蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP)-1B胰島素敏感性信號通路〔14〕。有研究認為運用“組學(-omics)”研究技術將是未來揭示體育運動延緩衰老分子機制的重要途徑〔16〕。包括蛋白質組學(Proteomics)在內的組學技術均以其高分辨率、高流通量等優點，廣泛應用于對疾病機制研究〔17，18〕。尤其近年來在肝臟生物學領域的應用較為普遍〔19〕，然而，在運動科學領域鮮有研究。因此，本研究通過雙向凝膠電泳(2-DE)串聯質譜技術和蛋白組學技術，研究8 w中等強度低負荷量運動對18月齡増齡大鼠肝臟組織的蛋白質組表達圖譜的影響，揭示長期訓練延緩肝臟衰老的整體機制，為體育運動延緩衰老的分子機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 IPGphor等電聚焦電泳系統(Amershan Pharmacia公司)、聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直平板電泳槽(購自bio-rad公司)、MDLDI-TOF MS質譜儀(Bruker Daltonics公司)、GDS 8000pc凝膠成像分析系統(中晶科技)；固相pH梯度等電聚焦千膠條(Immobilise dry strip pH3～10、長度18 cm，Amersham公司)、載體兩性電解質pH3～10和pH5～8(Amersha公司); V5111胰蛋白酶(Trypsin，Promega公司)；基質-氰-4-羥肉桂酸(美國ICN生物醫學公司)；碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺和三羥甲基氨基甲烷(Tris)均為化學分析純(上海生物工程技術有限公司)；線粒體丙二醛(MDA)、錳離子超氧化物歧化酶(MnSOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2樣品制備

1.2.1分組與實驗方案 12只18月齡清潔級雌性SD大鼠購于廣州中醫藥大學動物中心，體重(378±11)g，清潔級。分籠飼養，每籠4只，室溫20～24℃、光照7∶00～19∶00。適應性喂養1 w，隨機分為對照組和運動組。負荷強度參照李方暉等〔18〕。運動組進行8 w中等強度低負荷量運動(速度15 m/min，60%～70% max)跑臺坡度5°，每組15 min，5 d/w。

1.2.2肝臟組織的蛋白提取 運動訓練結束后24 h，運動組和對照組同時麻醉，測量體重和肝臟稱重。對照組和運動組大鼠肝臟組織40 mg，置于2 ml離心管中，剪成小塊；然后加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)后超聲，12 000 r/min離心10 min，收集沉淀，重復該步驟兩次。常溫干燥5 min后，30℃恒溫水浴溶于裂解液中，體積比1∶8加入裂解液{7 mol/L尿素；4% 3-〔3-(膽酰胺丙基)二甲氨基〕丙磺酸內鹽(CHAPS)；2 mol/L硫脲；60 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)；10 mmol/L 三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)；1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)；1 mmol/L PMSF；0.5 %兩性電解質(CA)}，室溫下12 000 r/min離心10 min，取上清，并再次離心取上清。收集樣品置于-80℃冰箱內。

1.32-DE分離、染色和圖像分析 雙向電泳分離參照Amersham Biosciences公司，具體實驗條件參照文獻〔17，18〕。銀染法顯色2-DE重復3次實驗，GDS 8000pc凝膠成像分析系統采集圖像，Image Master 2D 5.0軟件對圖像蛋白質斑點檢測背景扣除匹配分析。

1.4基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜鑒定差異表達蛋白鑒定 酶解選擇重復性好、無明顯變形拖尾的蛋白質點，然后將肽段提取液干燥后，加入2.5 L的0.5%(V/V)三氟乙酸(TFA)溶液溶解肽段，具體實驗步驟參照文獻〔17，18〕，以MALDI-TOF質譜分析進行多肽質量指紋圖譜的分析與比較。

1.5MDA、MnSOD、GSH及GSSH測定 依南京建成生物工程研究所試劑盒說明操作。

1.6統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件進行獨立樣本t檢驗。用Image Master 2D Platinum V5.0分析軟件檢驗差異蛋白點相對含量的差別是否有統計學意義。

2 結 果

2.1運動對增齡大鼠肝臟抗氧化酶的影響 與對照組相比，運動組GSH、MnSOD活性、GSH/GSSH比值分別增加了138% (P<0.05)、33% (P<0.05)和306% (P<0.01)；MDA和GSSH分別減少了60% (P<0.05)和71%(P<0.05)。見表1。

表1 兩組MDA、GSH、GSSH、MnSOD比較

2.2運動對增齡大鼠肝臟組織全蛋白質影響 絕大多數蛋白質分子量位于20～90 kD，對照組蛋白質斑點數目約為600個。運動組肝臟全蛋白質斑點數目分布規律和分子量大小與對照組很相似，只存在著少量差異蛋白質斑點，如圖1標識號碼為 A1～A19和圖 2標識號碼為 B1～B16共35個蛋白質斑點，無蛋白缺失。其中，與圖2相比，圖1中7個斑點(A2、A8、A9、A10、A12、A13和A16)上調超過2倍；與圖1相比，圖2中的5個斑點(B2、B5、B6、B8和B10)上調超過2倍；其他的23個差異斑點變化均在1～2倍。

圖1 運動組肝臟全蛋白2-DE

2.3差異蛋白質鑒定 對圖3所顯示的差異蛋白質進行逐一鑒定與分析(PMF和MASCOT網站提供的檢索工具)。檢索基本條件為：PMF圖譜中的肽片段質量為600～3 000 Da，最大允許誤差為0.2 Da，離子類型選擇單同位素分子量〔M+H〕+，酶解的漏切位點為1/2個。對12個差異蛋白質斑點，其檢索與比對結果見表2。蛋白質斑點均獲得有意義檢索結果，得分均>50分，具有一定的可信度。

圖2 對照組肝臟全蛋白2-DE

A.：對照組；B：8 w運動組圖3 大鼠肝臟表達的差異蛋白質斑點局部放大圖(×10)

表2 運動后增齡大鼠肝臟表達的差異蛋白質鑒定結果

續表2 運動后增齡大鼠肝臟表達的差異蛋白質鑒定結果

3 討 論

3.1運動對增齡大鼠肝臟氧化-抗氧化系統的調節 除了作為體內最大實質消化器官，肝臟還兼具儲存、分泌、解毒等代謝功能。如肝臟在增齡過程會因抗氧化酶活性下降導致肝細胞氧化應激損傷。Momchilova等〔20〕研究發現，增齡大鼠肝臟MnSOD、GSH活性顯著降低，而活性氧和表征脂質過氧化的MDA顯著增加。蔣春筍等〔11〕研究表明，中等強度有氧運動可通過降低線粒體膜通透性轉換開放的敏感性來抑制衰老組織線粒體活性氧(ROS)產生，進而減輕線粒體的氧化損傷。研究證實，抗氧化物白藜蘆醇也能通過調節GSH、MnSOD活性來保護增齡大鼠肝臟組織的氧化應激損傷〔20〕?？傊?，中等強度耐力運動可通過MnSOD、GSH活性來抑制增齡大鼠肝細胞線粒體活性氧的產生，進而維持肝細胞的氧化-抗氧化穩態。

3.2運動對肝臟蛋白質圖譜的影響 本文參見萬莉莉等〔17〕選用的丙酮/三氯乙酸(TCA)沉淀法提取大鼠肝臟全蛋白質，并進行了比較分析。結果表明，全蛋白質經2-DE分離后，選用丙酮/TCA沉淀法制備的大鼠肝臟全蛋白質斑點均有較高的分辨率，分布趨勢較為均勻，蛋白分離較好，重復性較好。其中，經比較分析發現，pH3.0～10.0范圍的載體兩性電解質是最佳等電點分離區域，可有效分離全蛋白質和蛋白質組學研究。

本研究中對照組圖譜與Hu等〔21〕文獻中報道的大鼠肝臟組織的全蛋白圖譜一致，但不同于大鼠的骨骼肌〔18〕、腦組織〔22〕和心肌組織〔23〕等全蛋白質分布特點。本研究結果推測，差異蛋白質斑點與運動提高肝臟抗氧化活性、延緩肝臟組織衰老的應激適應性蛋白質有關。

3.3運動對增齡大鼠肝臟蛋白質圖譜差異蛋白分析 表2中的 12個差異蛋白質分別可分為5個功能類別：(1)脂肪酸合成及其炎癥反應；(2)糖代謝；(3)抗氧化、解毒；(4)蛋白質穩態調節；(5)應激反應蛋白。

3.3.1脂代謝相關蛋白 脂肪酸合成酶(FAS)(A2)和11-羥化類固醇脫氫酶(11β-HSD1)(A10)主要存在于肝臟、脂肪等組織中，分別作為合成脂肪酸和催化無活性的可的松為氫化可的松關鍵酶，在調節機體糖脂代謝和炎癥反應發揮重要作用。劉云〔24〕研究發現，11β-HSD1刺激3T3-Ll細胞的分化過程中與FAS的上調有關?？焖倮匣∈?SAMP8)和增齡大鼠(22月齡)實驗表明，增齡會誘導肝臟組織脂質代謝傾向于脂肪過度合成〔25〕，導致肝臟炎癥反應和衰老的加劇，FAS〔26〕和11β-HSD1〔27〕扮演重要角色。與自然衰老大鼠模型相似，非酒精性脂肪肝大鼠模型進行運動訓練后，發現小鼠肝臟FAS〔28〕、11β-HSD1〔29〕表達顯著減少，從而有利于降低體內脂肪堆積和炎癥反應。

3.3.2糖代謝相關蛋白 α-烯醇化酶(α-enolase)(A9)和葡萄糖磷酸變位酶(PGM)(B5)分別是糖酵解和糖原合成及分解的關鍵酶，二者與機體糖代謝、炎癥反應和細胞凋亡密切相關。然而，肝細胞病變過程中，肝臟組織α-enolase分泌增加導致誘導肝臟纖維化和肝細胞損傷〔30〕；PGM表達水平減少導致肝細胞線粒體能量代謝水平及ATP合成降低，誘發肝細胞凋亡〔31〕。Lushchak等〔32〕研究發現，運動訓練可增加肝細胞PGM蛋白表達，進而維持肝臟組織的能量平衡。

3.3.3抗氧化、脫毒性和凋亡相關蛋白 乙基丙二酸腦病變相關蛋白(ETHE1)(A13)基因編碼硫加氧酶(SDO)，在肝臟中高度表達，參與將線粒體中硫化氫(H2S)催化為無毒的硫酸鹽〔33〕。ETHE1蛋白表達與機體的最大吸氧量呈正相關〔34〕，ETHE1蛋白表達下調易導致細胞內硫代謝途徑失調，引發線粒體功能失調〔33〕。此外，ETHE1也能通過調節組蛋白去乙?；?HDAC)1活性抑制p53誘導的肝細胞凋亡〔35〕。作為肝實質細胞角蛋白的重要組成之一，角蛋白8(K8)被認為是肝組織損傷和肝細胞凋亡的標示物〔36〕，對維持肝細胞結構和功能的完整具有重要的生理作用〔37〕，同時參與調控肝細胞線粒體的能量代謝和氧化應激過程〔38〕。S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMs)催化底物L-甲硫氨酸和ATP生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，后者是主要體內的甲基供體及GSH的前體物質。肝臟組織SAMs失活導致的甲硫氨酸代謝途徑失調引起肝細胞FAS表達增加和脂肪酸過度堆積，同時肝臟炎癥因子過度表達，誘發肝細胞凋亡發生〔39〕。核基質結合因子(SAF)B是一種核基質結合因子，定位于核基質中，已被證實在多種細胞學的過程中發揮重要作用，包括RNA轉錄后加工，細胞增殖、應激反應、細胞衰老和凋亡等。研究表明，SAFB通過它的N-末端結合域與p53抑制p53轉錄活性，從而抑制其下游調控基因的轉錄〔40〕。

3.3.4蛋白質代謝相關蛋白 蛋白酶體β亞單位(PSMB)6參與構成26 S蛋白酶體蛋白水解的核心區，26 S是20 S蛋白水解酶家族成員之一。PSMB6對于維持肝組織功能、肝細胞活性具有重要作用〔41〕。Hayashi等〔42〕研究發現，增齡大鼠肝細胞內聚集大量無法水解的結構異常是蛋白質與26 S蛋白酶體含量減少有關。核糖核酸酶抑制因子(RNH)1是一種多功能的體內重要的調節分子，是核糖核酸酶(RNase)的抑制劑，它與RNase緊密結合，導致核糖核酸酶的活性受到抑制。在衰老過程中，人體RNH1活力下降，RNase活力上升，RNA降解加快和蛋白合成速度下降，引起組織萎縮、生理功能下降。結合本研究可推測，運動訓練可通過調節26 S蛋白酶體和RNH1來優化肝臟組織的蛋白質代謝過程，維持蛋白質穩態。

3.3.5應激反應蛋白 在炎性應激刺激下，肝臟大量合成并分泌相關的急性期蛋白，如，觸珠蛋白(HPT)、主要急性期蛋白(MAP)1。MAPα-1是一種正相急性期蛋白，又稱T-kininogen 2，具蛋白酶抑制、巰基蛋白酶抑制劑、血管擴張的功能，在急性反應期對機體起保護作用。HPT主要由肝細胞分泌，與肥胖相關的肝臟組織纖維化的和肝臟胰島素信號激活有關〔43〕。提示，肝臟組織的分泌行為適應性變化也介導了運動訓練對肝臟組織的保護過程。然而值得指出的是，作為機體重要的內分泌組織，衰老大鼠的肝臟組織分泌行為在運動后的適應性變化在肝臟自身及系統性功能維護過程中扮演何種角色有待進一步研究揭示。

綜上，中等強度低負荷量訓練后增齡大鼠肝臟的蛋白質組表達圖譜發生顯著性變化；體育運動可能通過調節肝臟的糖脂代謝、蛋白質代謝、脫毒性和抗凋亡等過程來延緩肝臟組織衰老的作用。