千年草提取物對人成纖維細胞膠原蛋白合成的影響及其抗衰老作用

徐藝丹 徐彬彬 韓銀淑

(廈門醫學院公共衛生與醫學技術系醫學美容教研室，福建 廈門 361023)

千年草是生長在韓國濟州島、牙山等地的一種仙人掌，被稱為"手巴掌仙人掌"，是一種可食用仙人掌。該品種個頭矮小，果實為紅色，具有很強的抗寒能力，能耐受-5℃的酷寒〔1〕。其果肉富含多種蛋白質、維生素、微量元素等，營養豐富，仙人掌還具有抑菌、消炎、增強免疫力、降血糖、抗脂質過氧化、促進血液循環等多種藥用價值，臨床廣泛用于治療消化不良、胃痛、痢疾、痔血、咳嗽、糖尿病等多種疾病。除了食用價值和藥用價值，研究報道仙人掌果實具有抗氧化性，能加速創口愈合，抗衰老，增加皮膚的柔軟度，補充皮膚水分防止皮膚干燥，是保養皮膚的佳品〔2，3〕。本研究分別通過熱水和乙醇提取千年草的皮、莖和籽，探究各種千年草仙人掌提取物體外抗氧化作用，及細胞內清除活性氧(ROS)作用，對細胞的增殖作用，對膠原蛋白合成的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 千年草仙人掌、1，1二苯基-2三硝基苯肼(DPPH)、偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)購自Sigma 公司；人皮膚成纖維細胞系 HSAS1購自繼和生物科技，其余化學試劑均為分析純。電子天平購自上海精密儀器儀表有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱上海精宏實驗設備有限公司；RE-5299(2L)旋轉蒸發儀鞏義市瑞力儀器有限公司；紫外光分光度計上海棱光技術有限公司；艾本德 5810R臺式高速離心機；超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2提取工藝 千年草分為籽、皮和莖三部分，經統一干燥，粉碎，過60目篩，得到對應的千年草仙人掌籽、皮、莖粉末。水提液:分別稱千年草仙人掌籽、皮、莖粉末各10 g，分別加入250 ml 65℃熱水，60℃水浴、200W超聲功率浸泡提取1 h，抽慮，重復上述步驟3次，合并濾液，以3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。乙醇提液∶分別稱千年草仙人掌籽、皮、莖粉末各10 g，分別加入250 ml 60%乙醇，60℃水浴、200 W超聲功率浸泡提取1 h，抽慮，重復上述步驟3次，合并濾液，以3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。水提液和乙醇提液分別在60℃下減壓旋轉蒸發為10 ml，經冷凍干燥分別得到籽、皮和莖的干燥粉末。

1.3DPPH清除活性〔4〕在96孔板中依次加入不同濃度的千年草熱水提物和乙醇提物100 μl和DPPH溶液，避光放置孵育30 min后，在517 nm波長處測定其吸光度(A1)。以等體積蒸餾水替代DPPH溶液，按上述步驟操作，測定吸光度值A2。以等體積的95%乙醇代替樣品溶液作為空白對照，按上述步驟操作，測定吸光度(A3)。以Vit C(VC)為陽性對照，DPPH自由基清除率(%)=〔1-(A1-A2)/A3〕×100%，計算半抑制濃度IC50。

1.42，2聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)清除活性〔5〕在96孔板中依次加入不同濃度的千年草水提物和醇提物250 μl和ABTS溶液50 μl，避光放置孵育6 min后，在734 nm波長處測定其吸光度(A3)。以等體積蒸餾水替代ABTS溶液，按上述步驟操作，測定吸光度值A4。以等體積的95%乙醇代替樣品溶液作為空白對照，按上述步驟操作，測定吸光度(A5)。以VC為陽性對照，ABTS自由基清除率(%)=〔1-(A3-A4)/A5〕×100%，計算半抑制濃度IC50。

1.5人皮膚成纖維細胞培養 將復蘇后的人皮膚成纖維細胞置于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中進行傳代培養，每2 d更換1次培養液，培養至對數期。

1.6千年草提取物細胞內 ROS清除活性將傳代培養至第48代的人皮膚成纖維細胞配制成5×104個/ml的細胞懸浮液，于96孔培養板接種，培養24 h 后分別使用不同濃度的偶氮二異丁脹鹽酸鹽(AAPH)溶液處理2、4、6、8 h，采用2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯 (DCFHDA)試劑盒測定 ROS活性氧清除能力，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行，確定AAPH最佳造模濃度和處理時間。以最佳的AAPH濃度和造模時間為模型，37℃5%CO2培養，在細胞貼壁培養24 h后分別加入1、10、50、100 μg/ml濃度的熱水提物和乙醇提物培養1 h(對照組加入等體積血清)后，加入最佳AAPH造模濃度進行最佳處理時間處理，處理完畢后，除去AAPH，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，再加入新鮮無血清培養基繼續培養至16 h，使用2 μl DCFHDA熒光探針試劑盒進行ROS活性氧清除能力檢測，使用熒光分光光度計檢測拍照，激發波長為485 nm，發射波長為530 nm。

1.7千年草提取物的細胞增殖作用 配置1.6中細胞懸浮液于96孔培養板接種，待細胞貼壁生長24 h后分別加入1、10、50、100 μg/ml濃度的水提物和醇提物，每個濃度設置3個平行樣，對照組加入等體積空白血清，37℃ 5%CO2培養72 h，用PBS沖洗，再加入2 mg/ml的噻唑藍(MTT)溶液30 μl，繼續培養4 h，除去上清液，加入150 μl DMSO，充分震蕩，于570 nm波長下測定其吸光度值，與空白對照比較，計算細胞增殖率。

1.8千年草提取物對膠原蛋白合成的影響 將2 ml培養至對數期的人皮膚成纖維細胞以3×105個/ml濃度植入帶有蓋玻片的培養版中，蓋玻片在培養前經多聚賴氨酸處理，用含10% FBS的DMEM培養液，培養24 h后，分別加入1、10、50、100 μg/ml濃度的千年草熱水提物和乙醇提物，每個濃度設置3個平行樣，對照組加入等體積血清，培養7 d后，使用 PBS緩沖液清洗蓋玻片，然后用5%丙酮固定，使用H2O2去除過氧化物酶，加入一抗，37℃下孵育2 h，加入二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，采用蘇木素復染細胞核，中性樹膠封固。使用光學顯微鏡觀察，以棕黃色為陽性，每張蓋玻片隨機選擇10個視野進行觀察，通過LEICAQ軟件進行灰度分析，觀察Ⅰ型膠原蛋白的表達，灰度值越低表示Ⅰ型膠原蛋白含量越高。

1.9統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗、單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1DPPH、ABTS清除活性 千年草籽、皮、莖的熱水提取物和乙醇提取物的DPPH、ABTS清除率均隨著濃度的增加而升高(P<0.05)。千年草提取物的DPPH、ABTS清除率均明顯低于同等濃度的陽性對照組(P<0.05)。見表1、表2。千年草各部分提取物的DPPHIC50、 ABTS IC50值均明顯高于陽性對照組(均P<0.05),千年草各部分提取物中，千年草籽乙醇提取物的DPPH、ABTS清除能力最強，見表3。

表1 千年草不同提取物及陽性對照組的DPPH清除率

表2 千年草不同提取物及陽性對照組的ABTS清除率

表3 千年草提取物 DPPH、ABTS清除活性

2.2千年草提取物細胞內ROS清除活性 隨著千年草提取物濃度的升高人皮膚成纖維細胞ROS活性逐漸被抑制，其中，50 μg/ml，100 μg/ml 濃度的千年草籽乙醇提取物的ROS清除活性最強，見表4。

2.3千年草提取物的細胞增殖作用 隨著千年草提取物濃度的升高人皮膚成纖維細胞的增殖率逐漸升高，與1 μg/ml千年草熱水提取物和乙醇提取物相比，10 μg/ml以上濃度的對應部分的千年草提取物能夠使人皮膚成纖維細胞的增殖率顯著上升(P<0.05)，且100 μg/ml千年草籽的乙醇提取物和熱水提取物的促進作用最強，見表4。

表4 千年草提取物對人皮膚成纖維細胞ROS清除活性的影響

2.4千年草提取物對膠原蛋白合成的影響 隨著千年草提取物濃度的升高人皮膚成纖維細胞膠原蛋白合成率逐漸增強(P<0.05)，其中，濃度為50 μg/ml的千年草籽熱水提取物膠原蛋白合成率最高，見表5。

表5 千年草提取物對人皮膚成纖維細胞膠原蛋白合成率的影響

3 討 論

仙人掌含有多種多糖、生物堿、黃酮類、化黃酮合物、皂苷、蔽類等活性成分〔6〕，本研究分別采用熱水浸提和乙醇浸提，提取物主要成分可能為粗多糖、多酚類、黃酮類物質，這類物質均具有良好的抗氧化活性。國內常見的米邦塔、仙巴掌、梨果仙人掌、量天和仙人掌都具有良好的清除自由基能力，文獻報道這4種仙人掌的羥自由基清除活性低于蘆丁〔7〕。本研究發現千年草提取物均具有清除DPPH、ABTS自由基活性，但其活性弱于同濃度的VC，各種提取物中，千年草籽乙醇提物的清除 DPPH、ABTS 自由基能力最強，IC50濃度最低。ROS 是一種強氧化劑，是細胞內代謝后的有害產物，活性氧包括氧自由基、丙二醛等，可以對脂質造成過氧化，損害細胞的脂質雙分子層，加速細胞衰老，損害細胞功能，過量的ROS會損害膠原蛋白，引起皮膚松弛、產生皺紋，過量的ROS還會引起機體內氧化應激反應過度，引起多種疾病〔8〕。本研究結果表明千年草熱水提取物和乙醇提取物對人皮膚成纖維細胞 ROS活性均具有抑制作用，其中千年草籽乙醇提取物的ROS抑制作用最強，說明千年草仙人掌具有一定的抗氧化、清除自由基能力，這與Cho等〔9〕報道有相似之處。但對于其發揮抗氧化清除自由基的具體有效成分還需進一步研究。

皮膚衰老和皮膚受損后的修復是一個復雜的生物學過程，成纖維細胞能夠合成I型膠原蛋白活性，是重要的修復細胞之一。皮膚修復的生物過程通常是由成纖維細胞的增殖分化來完成的，人皮膚成纖維細胞是研究膠原蛋白、皮膚衰老的常用細胞模型〔10〕。研究認為人皮膚成纖維細胞的膠原蛋白分泌量在1 w左右達到峰值〔11〕。本研究發現千年草提取物在10 μg/ml以上時對人皮膚成纖維細胞增殖均有一定的促進作用，且隨著濃度增加，其促進作用增強，同一濃度的不同提取方法及不同部位千年草提取物對人皮膚成纖維細胞的增殖作用無顯著差異，說明千年草提取物無明顯細胞毒性，且對Ⅰ型膠原蛋白的合成具有促進作用，隨著濃度增加，促進作用增強，濃度為50 μg/ml的千年草籽熱水提取物膠原蛋白增加率最高。牟麗秋等〔12〕采用杜仲提取液與MC3T3-EI成骨細胞在體外進行共培養，發現杜仲提取液具有促進細胞增殖、分化的作用，認為京尼平苷和綠原酸是促進其增殖的主要有效成分，京尼平苷和桃葉珊瑚苷是促進大鼠膠原蛋白合成的有效成分。ROS會促進膠原蛋白凋亡，引起細胞損傷，千年草提取物具有清除ROS活性，這可能是其對人皮膚成纖維細胞的增殖作用及對Ⅰ型膠原蛋白活性的促進作用、抗衰老的原因之一